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目的:(1)确定Ad-HGF感染人股动脉内皮细胞(HFAECs)的最佳感染强度,初步探讨肝细胞生长因子(HGF)对HFAECs的Notch1和Dll4基因转录的调节作用,为进一步探讨HGF与Notch信号通路的关系奠定基础;(2)探讨HGF对HFAECs的Dll4-Notch-Hey2信号通路的激活作用,及此通路激活后对HFAECs增殖和迁移能力的影响,从血管新生的角度来阐明Notch信号调控HGF促动脉形成的作用及机制。(3)体外分离培养及鉴定人内皮祖细胞(EPCs),为下一步从血管发生的角度探讨HGF是否通过Notch信号通路调控祖细胞的分化来促动脉形成的机理提供体外细胞模型。方法:第一部分体外培养HFAECs,并用不同感染强度(MOI)(50,100,150,200,250,300pfu/cell)的携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-GFP)转染HFAECs,通过流式细胞仪(检测转染效率)和MTT法(检测细胞损伤程度)筛选和确定最佳MOI(高转染效率且对细胞低损伤),作为下一步携带HGF基因的重组腺病毒(Ad-HGF)转染细胞的最优条件。Ad-HGF以最佳的MOI转染HFAECs48h后,收集细胞上清,用ELISA法检测HGF蛋白的表达水平,选取HGF表达水平最佳的细胞提取总RNA,通过反转录PCR(RT-PCR)来检测Notch1和Dll4基因的转录水平。以转染Ad-GFP的细胞作为对照。第二部分基于前期研究,Ad-HGF以最佳MOI(200 pfu/cell)转染HFAECs后0h、24h、48h、72h,分别收集细胞上清,用ELISA法检测不同时间点HGF蛋白的表达水平;同时收集细胞提取总RNA,通过RT-PCR检测不同时间点HFAECs中Notch1、Dll4和Hey2基因的转录水平;并采用MTT法和Transwell迁移实验分别观察HFAECs增殖和迁移能力的变化及与Dll4-Notch-Hey2信号通路激活的关系;均以转染Ad-GFP的细胞作对照。第三部分无菌、肝素抗凝,取脐血(兰州军区总医院妇产科提供,产妇均知情同意)作为EPCs的标本来源。用PBS等倍稀释后取7 mL脐血缓慢加入装有3mL淋巴细胞分离液的离心管中,2000r/min离心25min,取云雾状灰白色层单个核细胞。将细胞接种在人纤维粘连蛋白包被的6孔板中,培养于M-199培养基中。观察贴壁细胞的形态变化;采用免疫细胞化学法鉴定EPCs。实验数据采用SPSS13.0软件进行统计分析。结果:(1)以高转染效率且对细胞低损伤为标准,确定最佳MOI为200 pfu/cell;ELISA法检测HGF表达水平的结果显示,Ad-GFP组:(3.672±0.810) ng/ml;Ad-HGF组:(86.318±3.864)ng/ml。两组比较转染后48 h的HGF表达水平有统计学差异(P＜0.05);(2) Ad-HGF转染HFAECs48 h后,RT-PCR结果显示,通过紫外凝胶分析仪,可观察到Ad-HGF组的Notch1和Dll4基因转录水平明显上调;应用凝胶成像分析系统分析凝胶成像图中目的基因的相对强度,结果显示:Ad-GFP组和Ad-HGF组的数据分别为:Dll4,0.788±0.021和0.936±0.018;Notch1,0和0.458±0.023,两组间进行单侧t检验分析,P＜0.05,有统计学意义。Ad-HGF组目的基因的相对强度明显高于Ad-GFP组;(3) Ad-HGF转染HFAECs不同时间段后,ELISA检测HGF表达水平的结果显示:Ad-HGF有效的导入了细胞,且HGF表达水平48 h内有时间依赖性,72h开始下降;(4) Ad-HGF转染HFAECs不同时间段后,RT-PCR的结果显示:通过紫外凝胶分析仪,发现在0h仅能检测到Dll4基因的转录,在48 h内Notch1和Dll4基因转录有时间依赖性,72h时Notch1基因转录已检测不到,Dll4基因转录也明显减弱。Hey2的转录水平的变化与Notch1相一致。凝胶成像分析系统软件处理结果与上述观察结果一致;(5)在转染Ad-HGF不同时间段的HFAECs的MTT试验中初步观察到,与对照组相比,在各个时间点Ad-HGF组的HFAECs的增殖和存活能力明显增强;Transwell迁移实验结果表明,迁移介质中不含HGF时,两组细胞的迁移能力在各个时间点差异不明显(p＞0.05);迁移介质中含HGF时,在24h、48h Ad-HGF组细胞的迁移能力明显强于对照组(p＜0.05),且迁移能力在48h强于在24h但无统计学差异(p＞0.05);(6) EPCs体外培养形态观察结果:细胞呈梭形,随培养时间的延长呈“铺路石”样,与有关文献报道相一致;(7)免疫细胞化学法鉴定EPCs的结果显示:分离培养的细胞VEGFR-2和CD133均呈阳性反应,CD34反应较弱。结论:(1) HGF对HFAECs的Notch1受体和Dll4配体有诱导作用。暗示了HGF促动脉形成机制可能与Notch信号通路有一定的关联性;(2) HGF可能通过激活动脉内皮细胞的Dll4-Notch-Hey2信号通路,间接地增强动脉内皮细胞增殖和迁移能力,来促进子代动脉分支的形成;(3)采用密度梯度离心法从人脐血中分离培养的细胞具有EPCs特性,可作为我们所需的体外细胞模型。