环境污染物进入生命体后,污染物及其代谢产物可选择性地与特定生物靶蛋白相互作用,进而影响生命体的正常生理过程并产生相应的生物效应。污染物与靶蛋白的相互识别与结合,是致毒作用产生的首要前提。目前,环境毒理学主要以污染物分子的结构与毒理机制研究为落脚点,探索其与未知靶点作用后表现出来的环境损伤和健康危害,基于污染物自身结构特征的定量结构-活性相关研究技术得到广泛应用。但是,基于小分子污染物结构的决定作用尚不能完全诠释复杂的致毒机制,更无法阐明污染物与多种生物靶相互作用导致的多生物评价终点效应。因此,从分子水平上分析探讨污染物与靶蛋白相互作用的微观分子机制,特别是采用理论模拟与生物信息学等环境计算毒理方法实现污染物生物靶选择及其与靶作用的理论计算,不仅有助于全面评价环境污染物的毒性,而且对揭示其致毒作用机制至关重要。本研究拟以典型有机污染物与生物靶蛋白的微观作用机理及其产生的生物学效应为研究重点,关注生物靶蛋白的分子特征及结构可塑性对污染物生态效应表现的影响。通过应用生物信息学、系统生物学、分子毒理等多学科理论与方法,建立和发展结合了生物信息学、化学信息学等技术的同时基于靶点和配体结构的三维定量结构活性相关方法,获得受限于方法灵敏度的实验手段所无法测试的分子水平信息；探索污染物与生物大分子作用模式并揭示其毒理微观机制,阐明多靶点选择的化学机制,探索非单调剂量-效应关系的可能形成机制；从分子水平上将污染物结合引发的生物靶结构调整与其相对宏观的环境内分泌干扰效应进行关联,揭示与人体健康密切相关的环境污染物内分泌干扰效应的分子机制,为保障环境安全和人体健康提供理论基础和方法支持。依据以上研究目的,本论文主要开展以下三方面具体工作：1.污染物结合引发的典型生物靶蛋白结构适应性调整机制将分子相似性分析、分子柔性对接、分子动力学和定量构效关系等计算毒理方法相互整合,诠释生物靶蛋白柔性特征对污染物结合模式和生物效应的影响机制,探讨污染物结合引发的生物靶结构调整及其与终点效应表现的内在联系,阐明关键氨基酸侧链取向、LBD二级结构适应性调整和三级结构变化等不同尺度上靶蛋白柔性对于污染物结合模式和毒性效应的决定作用。(1)Arg394对于雌激素受体Alpha亚型(ERα)活性口袋可塑性的调节作用雌二醇衍生物与雌二醇及其代谢产物具有相似的化学结构,目前已被证实对于野生生物和人类的健康有害。然而,该类化合物与生物靶点的微观分子作用机制尚不明确。采用柔性分子对接方法研究9种雌二醇衍生物与ERa的结合模式,特别是Arg394对于靶蛋白活性口袋可塑性的调节作用。发现重组基因酵母测评实验获得的log(EC50)值与计算得到的亲合力具有很好的线性相关关系,相关系数r2为0.9913。研究发现Arg394是ERa活性位点的关键柔性氨基酸,由于其侧链的柔性,炔雌醚可与人类ERa在确保Glu353和Arg394盐桥保守性的前提下发生诱导契合效应,这一发现扩展了能通过ERa介导导致内分泌干扰效应的污染物的结构范围。(2)Leu300对于hALR2二口袋开关的决定作黄酮类物质是一种在植物源食品中广泛存在的内分泌干扰物,一些类黄酮物质对人类醛糖还原酶(hALR2)具有很强的抑制活性,本研究采用分子相似性分析,柔性分子对接和分子动力学手段模拟了56种类黄酮物质与人类醛糖还原酶的结合模式。通过分子相似性分析技术将56种类黄酮物质分为两类,分子模拟显示Leu300氨基酸是控制hALR2第二口袋开关的关键残基,在hALR2与类黄酮物质诱导契合作用中扮演重要角色；且由于hALR2蛋白的柔性,49种Ⅰ型黄酮与第二口袋闭合酶蛋白构型结合,7种Ⅱ型黄酮作用于第二口袋开放的酶蛋白构型。基于黄酮化合物与hALR2不同作用机制的区分,分别建立了类黄酮物质hALR2抑制活性预测的CoMFA和CoMSIA模型。研究结果证实,hALR2配体结合区通过关键氨基酸Leu300构象的变化控制着酶第二结合口袋的关闭,成功实现了56种类黄酮化合物的模式识别。(3)结构可塑性对人参皂苷ER激动/拮抗效应影响的理论研究基于蛋白-蛋白作用研究了人参皂苷/ER复合物与辅因子PGC-1α的结合模式,揭示其诱导ER产生激动／拮抗效应的分子机制。研究发现,辅因子PGC-1α与激动型ER强结合,两个卡钳氨基酸Leu143和Leu147深深嵌入ER的表面疏水凹槽中,并且Leu143与Val376形成氢键。同时,PGC-1α含有的氨基酸Ser140和Leu146分别与氨基酸Glu542和Lys362形成氢键。辅因子PGC-1α与拮抗型ER无优势结合位点,原因在于拮抗剂结合后使H12螺旋移动并占据辅因子结合位点。在所研究的17种人参皂苷中PPT显示明确的拟雌激素效应,肠代谢产物M1显示明确的抗雌激素效应。2.手性有机磷与乙酰胆碱酯酶对映体选择性结合的理论与实验研究环境污染物的手性问题广泛存在,然而在对映体水平上对其毒性和生物效应的研究尚不完善。乙酰胆碱酯酶是有机磷农药的重要生物靶点,深入研究AChE的对映体选择性有助于阐明其分子毒理。采用分子对接方法识别六对手性有机磷农药与AChE配体结合区的作用模式,阐明手性有机磷农药与AChE相互作用对映体差异的分子基础。建立基于对映体选择的特定毒性污染物虚拟高通量筛选方法,在美国国家癌症研究所数据库20万化合物中初筛出24种潜在AChE抑制剂。采用ACllE竞争抑制实验和对映体特异性荧光表征实验进行验证,确认苯硫磷,1-萘苷和苯磺酰胺等3种未见报道的具有AChE抑制活性的化合物,其中苯硫磷具有明确对映体选择性；进一步采用分子模拟和荧光特征识别手段相结合确认S型苯硫磷对映体具有更高的抑制活性,揭示了苯硫磷与AChE作用的空间特异性分子机制。3.典型化学品多靶点复合效应的理论研究发展同时基于靶点和配体结构的3D-QSAR方法,提出基于构效模型探索确定作用靶点和结合模式的方法,探讨PCBs,OH-PBDEs和人参皂苷类中药成分等典型化学品的多靶点选择性结合机制,从分子水平探索典型污染物的体内作用靶点,阐明非单调剂量效应关系的产生机制。(1)PCBs诱导鸡胚肝细胞EROD舌性非单调剂量响应关系形成机制多氯联苯作为典型环境内分泌干扰物,在诱导鸡胚肝细胞EROD酶活性中呈现特殊非单调剂量一响应关系。分别对39种PCBs与芳烃受体配体结合区相似蛋白结构进行分子对接,分析模拟不同结构类型PCBs的芳烃受体结合模式并获得PCBs和AhR相互作用亲合力计算值。基于多元线性回归分析分别建立了高低剂量下PCBs对鸡胚肝细胞EROD活性影响的QSAR模型,在此基础上推测非单调剂量响应关系的形成源于高低剂量效应机制的差异。低剂量下11种PCBs主要通过芳烃受体介导发挥其对鸡胚肝细胞细胞色素P4501A正常生理功能的干扰效应,而高剂量下PCBs对鸡胚肝细胞产生急性毒性。究其可能的原因是处于低剂量的PCBs与特定受体结合作用起到主导地位；随剂量增加,细胞内的反馈调节作用使得EROD趋势减缓；而在剂量升高到一定程度,表现出一定反应性急性毒性机制,从而对鸡胚肝细胞的结构与功能产生损伤。(2)羟基多溴代二苤醚多靶点效应的理论研究多溴二苯醚(PBDEs)是近年来广泛关注的持久性有机污染物,其代谢产物羟基多溴代二苯醚可通过与T4和T3竞争甲状腺素转运蛋白干扰人体甲状腺素的调节功能。本研究采用CoMFA和CoMSIA方法构建羟基多溴代二苯醚与甲状腺激素结合球蛋白(TBG)、运甲状腺素蛋白(TTR)亲合力的预测模型。同时,利用分子对接技术研究OH-PBDEs与TBG、TTR的多靶点结合模式,发现与TBG形成氢键的关键氨基酸为Lys270,与TTR形成氢键的关键氨基酸为Leu110和Ser117。从分子水平上揭示OH-PBDEs与甲状腺素转运蛋白的微观分子机制,有助于全面评价OH-PBDEs对人体甲状腺素调节功能的损伤。(3)人参皂苷靶效应的理论研究天然中药成分人参皂苷具有抗肿瘤功效,但是人们往往忽视了其体内代谢产物的潜在内分泌干扰效应。采用分子对接方法分别研究人参皂苷与血管表皮生长因子受体(VEGFR)和雌激素受体(ER)的结合模式,揭示人参皂苷的抗肿瘤分子机制及其代谢产物的内分泌干扰效应分子机制。研究发现,人参皂苷通过抑制VEGFR表达进而导致肿瘤细胞缺血,三醇型皂苷的抗肿瘤效果优于二醇型皂苷。同时,人参皂苷进入人体后的雌激素效应不显著,但是其完全代谢产物原人参二醇和原人参三醇入血后可通过ER结合表现出一定的内分泌干扰效应。