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研究目的:本实验通过研究相关因子在大鼠系膜细胞及糖尿病肾功能不全大鼠模型中的表达,探讨chemerin对TGF-β1/Smads/CTGF信号通路及炎症因子的影响,阐明其在糖尿病肾病肾功能不全发病中的作用;同时通过分析肾功能衰竭患者临床生化指标,探索血清chemerin与肾功能衰竭患者的相关关系。研究方法:1、根据gene bank合成大鼠chemerin基因序列,在两端添加Hind III和Bam H I的酶切位点,对pc DNA?3.1(+)表达载体和chemerin全长同时进行双酶切后进行连接,构建chemerin表达载体。筛选阳性克隆,进行鉴定。2、以大鼠肾脏系膜细胞为研究对象,随机分为对照组、低糖组、高糖组、chemerin组、联合干预组。利用构建的chemerin表达载体,转染系膜细胞,应用Real-time PCR方法检测TGF-β1/Smads/CTGF信号通路m RNA水平,用Western blot法检测TGF-β1/Smads/CTGF信号通路蛋白表达情况,并进行半定量分析;使用ELISA法测定炎症因子TNF-α、IL-1的水平,探讨体外试验chemerin对于炎症因子、TGF-β1/Smads/CTGF信号通路的影响。3、以糖尿病肾功能不全大鼠为研究对象,分成正常对照组、生理盐水组、糖尿病肾功能不全组、chemerin组、联合干预组。利用构建的chemerin表达载体,注入大鼠肾脏,应用Real-time PCR方法检测TGF-β1/Smads/CTGF信号通路m RNA水平,用Western blot法检测TGF-β1/Smads/CTGF信号通路蛋白表达情况,并进行半定量分析;同时使用ELISA法测定炎症因子TNF-α、IL-1的水平,探讨体内试验chemerin对于炎症因子、TGF-β1/Smads/CTGF信号通路的影响。4、随机选取肾功能衰竭患者97名及45名健康对照者。根据肾功能衰竭的病因将患者分成糖尿病肾病肾功能衰竭组(DKD)和非糖尿病肾病肾功能衰竭(NDKD)组。ELISA法检测人血清chemerin水平,分析与肾功能衰竭患者临床生化指标的相关性,揭示两者的联系。研究结果:1、成功构建真核表达载体pc DNA?3.1(+)-chemerin,经PCR、双酶切鉴定证实目的片段与预期一致;通过测序证实序列与Gen Bank相一致。2、体外试验发现,高糖组及chemerin组大鼠系膜细胞中TGF-β1/Smads/CTGF通路各蛋白包括TGF-β1、Smad2、Smad4和CTGF m RNA及蛋白表达均有增加,炎症因子TNF-α、IL-1水平升高;联合干预组TGF-β1/Smads/CTGF通路及TNF-α、IL-1水平升高水平更明显。3、大鼠体内研究发现,糖尿病肾功能不全组及chemerin组中TGF-β1/Smads/CTGF通路各蛋白包括TGF-β1、Smad2、Smad4和CTGF m RNA及蛋白表达均有增加,炎症因子TNF-α、IL-1水平升高。联合干预组TGF-β1/Smads/CTGF通路及TNF-α、IL-1水平升高水平更明显。4、相比于对照组,非糖尿病肾病肾功能衰竭(NDKD)组与糖尿病肾病肾功能衰竭(DKD)组的血清chemerin水平显著升高,而糖尿病肾病肾功能衰竭(DKD)组的chemerin水平高于非糖尿病肾病肾功能衰竭(NDKD)组患者。女性患者的血清chemerin水平较男性患者差异无统计学意义。简单线性回归分析表明,校正年龄及性别两个因素后,血清chemerin水平与SBP、BUN、Cr、TG、CRP呈正相关,而与Ccr呈负相关。结论:1、成功构建真核表达载体pc DNA?3.1(+)-chemerin,为下一步转染研究chemerin的作用机制奠定基础。2、chemerin可能通过上调TGF-β1/Smads/CTGF通路及炎症因子水平加重大鼠系膜细胞损伤。3、chemerin可能通过上调TGF-β1/Smads/CTGF通路及炎症因子水平加重大鼠肾脏损伤,导致肾功能障碍。4、糖尿病肾病肾功能衰竭组患者血清chemerin水平明显升高,而且血清chemerin水平与肾功能密切相关。