论文部分内容阅读
核内不均一核糖核蛋白（Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins,hn RNPs）是一类RNA结合蛋白,可以通过与相应的靶标RNA结合,在RNA转录调控过程中发挥重要作用。hn RNPA/B亚家族蛋白是hn RNPs家族中最丰富的RNA结合蛋白,是形成核糖核蛋白复合物的核心。而hn RNPA2/B1是hn RNPA/B亚家族的一名成员。hn RNPA2/B1通过其外显子的可变剪接产生四种异构蛋白hn RNPA2、hn RNPB1、hn RNPA2b和hn RNPB1b,这些异构蛋白在结构组成上较为类似,但是却具有不同的功能。此外,在hn RNPA2/B1 N端含有两个RNA识别序列（RNA recognition motifs,RRM）,分别为RRM1（RNA recognition motif 1）和RRM2（RNA recognition motif2）,这两个区域高度保守,是自身抗体识别的主要抗原表位区,同时与RNA-蛋白质相互作用有关,并且参与调节RNA的可变剪接。在hn RNPA2/B1 C端含有一个富含甘氨酸的低复杂性（Gly-rich low-complexity area,LC）区域,该区域包括病毒样结构域（Prion-like domain,Pr LD）、精氨酸-甘氨酸-甘氨酸框（Arginineglycine-glycine box,RGG）及含有M9的核定位信号（M9 nuclear localization signal,PY-NLS）,LC区域与蛋白质-蛋白质相互作用、RNA结合和核定位等过程密切相关。hn RNPA2/B1可以通过这些结构域与DNA、RNA、转录因子和受体蛋白等结合,从而在多种生理和病理过程中发挥重要作用。单克隆抗体对抗原的识别具有较高的特异性和亲和力,是目前研究蛋白生物学功能的重要工具。尽管目前有商业化的hn RNPA2/B1单克隆抗体,但尚无针对该蛋白不同结构域的单克隆抗体的报道,而hn RNPA2/B1不同结构域又具有非常重要的功能。因此制备针对hn RNPA2/B1不同结构域的单克隆抗体对深入研究hn RNPA2/B1的生物学功能具有重要作用。为了获得针对hn RNPA2/B1不同结构域的单克隆抗体,本课题的工作主要从以下四个方面展开。1.hn RNPA2/B1全长蛋白和截短体蛋白的制备:首先分别克隆编码hn RNPA2/B1全长、hn RNPA2/B1 N端（aa 1-192）、hn RNPA2/B1 C端（aa 293-353）、hn RNPA2/B1截短体1（aa 21-104）、hn RNPA2/B1截短体2（aa 112-191）、hn RNPA2/B1截短体3（aa 202-230）、hn RNPA2/B1截短体4（aa 231-308）及hn RNPA2/B1截短体5（aa 309-331）等蛋白的8个基因片段,并将它们分别连入相应的原核表达载体中,成功获得p ET-28a/hn RNPA2/B1 no stop、p RSETB/GRNE-hn RNPA2/B1 N端、p RSETB/GRN-E-hn RNPA2/B1 C端、p GEX-4T-3/hn RNPA2/B1 N端、p GEX-4T-3/hn RNPA2/B1 C端及p RSETB/GRN-Ehn RNPA2/B1截短体1-5等共10个原核表达载体。将上述原核表达载体转入Rosetta（DE3）感受态中进行蛋白表达与纯化,共获得相应的10种原核蛋白。所获蛋白将用于后续单克隆抗体制备所需的免疫原以及单克隆抗体的鉴定。2.hn RNPA2/B1单克隆抗体的制备:将hn RNPA2/B1全长蛋白作为免疫原及筛选原,获得1株针对hn RNPA2/B1的单克隆抗体;将GRN-E-hn RNPA2/B1 N端蛋白作为免疫原,GST-hn RNPA2/B1 N端蛋白作为筛选原,获得20株针对hn RNPA2/B1的单克隆抗体;将GRN-E-hn RNPA2/B1 C端蛋白作为免疫原,GSThn RNPA2/B1 C端蛋白作为筛选原,获得3株针对hn RNPA2/B1的单克隆抗体。3.hn RNPA2/B1单克隆抗体的鉴定:首先通过Western blot对所获得的抗体的特异性进行鉴定,然后进一步鉴定其所识别的结构域及蛋白异构体,最后通过免疫荧光染色鉴定其是否可以识别天然的人源和鼠源的hn RNPA2/B1蛋白。结果显示这24株抗体特异性良好。获得的抗体hn RNPA2/B1 No.2-1（N）,括号内的N指的是采用hn RNPA2/B1 N端蛋白作为免疫原所获得抗体,其所针对的结构域为hn RNPA2/B1 RRM2结构域;hn RNPA2/B1 No.3-1（N）、hn RNPA2/B1 No.6-1（N）、hn RNPA2/B1 No.9-1（N）、hn RNPA2/B1 No.11-1（N）针对的结构域为RRM1和RRM2结构域;剩余抗体所针对的结构域均为RRM1结构域;获得的hn RNPA2/B1No.1-1（C）,括号内的C指的是采用hn RNPA2/B1 C端蛋白作为免疫原所获得抗体,针对的结构域为hn RNPA2/B1 RGG结构域;hn RNPA2/B1 No.2-1（C）针对的结构域为hn RNPA2/B1 Pr LD结构域;hn RNPA2/B1 No.3-1（C）针对的结构域为hn RNPA2/B1 Pr LD和PY-NLS结构域。hn RNPA2/B1 No.1-1（N）识别hn RNPA2一种异构体;hn RNPA2/B1 No.4-1（N）识别hn RNPB1一种异构体;hn RNPA2/B1No.6-1（N）、hn RNPA2/B1 No.8-1（N）、hn RNPA2/B1 No.9-1（N）和hn RNPA2/B1 No.2-1（C）可以同时识别三种异构体,分别为hn RNPB1、hn RNPA2和hn RNPB1b;其余的抗体所识别的异构体均为hn RNPB1和hn RNPA2两种。免疫荧光染色也证明除了hn RNPA2/B1 No.2-1（C）不能识别鼠源的hn RNPA2/B1的蛋白外,其它抗体均能识别人源和鼠源hn RNPA2/B1的真核蛋白。4.hn RNPA2/B1单克隆抗体的应用:前期通过对抗体的特异性以及识别的异构蛋白进行了鉴定,最后选择hn RNPA2/B1 No.1-1（N）、hn RNPA2/B1 No.2-1（N）和hn RNPA2/B1 No.4-1（N）这3株抗体进行后续石蜡切片免疫组织化学染色,且这三株抗体所针对的异构蛋白分别为hn RNPA2、hn RNPA2/B1和hn RNPB1。我们对获得的这3株抗体所针对的异构蛋白的功能进行了鉴定,首先对人正常脑组织和额颞叶痴呆（Frontal Temporal Dementia,FTD）和阿尔兹海默症（Alzheimer disease,AD）病理组织切片进行免疫组织化学染色,从而鉴定其是否可以识别正常和病理脑组织样本。结果显示hn RNPA2/B1 No.1-1（N）和hn RNPA2/B1 No.2-1（N）能识别人的正常脑组织,可观察到明显的核着色,但是hn RNPA2/B1 No.4-1（N）不能识别。同时用这三株抗体进行了人脑AD和FTD病理组织切片染色,结果表明,与正常人脑组织相比,在病理条件下hn RNPA2/B1 No.1-1（N）和hn RNPA2/B1 No.2-1（N）定位发生了变化,大部分迁移至细胞质。后续对鼠的创伤性脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）3天和7天的海马组织样本进行Western blot检测。结果表明,与对照组相比,损伤后3天和7天,损伤同侧海马组织中hn RNPA2表达量显著增加。此外,在损伤后3天,同侧海马中hn RNPB1的表达量显著减少,在损伤后7天,hn RNPB1的表达量显著增加。综上所述,本课题取得了以下研究结果:（1）成功制备了hn RNPA2/B1全长蛋白、hn RNPA2/B1 N端蛋白、hn RNPA2/B1 C端蛋白以及hn RNPA2/B1截短体1-5原核蛋白等共10种原核蛋白;（2）获得了24株特异性针对hn RNPA2/B1的单克隆抗体,并对其所针对的结构域和蛋白异构体进行了鉴定;（3）获得两株能识别正常组织以及病理组织的抗体:hn RNPA2/B1 No.1-1（N）和hn RNPA2/B1 No.2-1（N）,可用于免疫组织化学染色;（4）利用hn RNPA2/B1 No.1-1（N）和hn RNPA2/B1 No.4-1（N）通过小鼠TBI模型验证了hn RNPA2和hn RNPB1具有不同的功能。