1目的运用计算机数据挖掘技术探讨湿热型膝骨关节炎血清中超氧化物歧化酶(SOD)的变化及与药物、指标之间的关系,探讨中药内外合治法(健脾化湿清热通络法+中药外敷法)治疗湿热型膝骨关节炎的疗效,发现总结规律。并从临床研究及体外细胞研究探讨膝骨关节炎(KOA)患者氧化应激指标、致炎/抑炎细胞因子、AMPK-FoxO3a-MnSOD信号通路、生活质量及实验室指标变化,研究中医健脾化湿清热通络法对KOA患者的影响,体外实验探讨黄芩清热除痹胶囊(HQC)调节KOA氧化应激状态的作用机制。2方法2.1数据挖掘研究运用B/S系统作为其系统软件架构,以VisualStudio.NET作为软件开拓环境,SQL Server作为数据库软件。创建“安徽省中医院风湿科数据中心”。对KOA患者临床基本信息进行采集。运用关联规则、聚类分析以及随机行走等方法,分析湿热型膝骨关节炎血清中超氧化物歧化酶(SOD)的变化及相关性。分析健脾化湿清热通络法的临床用药规律,以及中药内外合治法(健脾化湿清热通络法+中药外敷法)改善湿热型膝骨关节炎患者SOD、免疫炎症指标的数据挖掘研究。2.2临床研究60例KOA患者来自2016年10月至2017年5月安徽省中医院风湿免疫科住院病人。随机数字表法分组为健脾化湿清热通络组(研究组)30例和氨基葡萄糖组(Glucosamine,GS)(对照组)30例,另设20例健康对照组来自本医院健康体检中心。ELISA法检测KOA血清中致炎/抑炎细胞因子,即白细胞介素6(IL-6)、IL-4、IL-10、IL-1β、IL-9、人转化因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、CD36,氧化应激指标,包括过氧化脂质(LPO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(TAOC)以及AMPK-FoxO3a-MnSOD通路相关指标;全自动生化分析仪进行测定免疫球蛋白G(IgG)、IgA、IgM、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、补体C3、补体C4;魏氏法检测血沉(ESR);流式细胞仪检侧CD36相对荧光强度;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测人体外周血液中PPARγ、AMPK、p-AMPK、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白表达;实时荧光定量PCR检测外周血PPARγmRNA、AMPKα1mRNA、FoxO3amRNA表达:采用问卷量表观察KOA患者生活质量及量表评分;观察两组KOA患者的疗效、致炎/抑炎细胞因子、氧化应激指标、AMPK-FoxO3a-MnSOD信号通路等的变化。2.3实验研究取6周龄SD雄性大鼠40只,随机分为高浓度黄芩清热除痹胶囊(HQC)组、中浓度HQC组、低浓度HQC组及生理盐水组、空白对照组5组,进行3天灌胃方法,制备不同组别的含药血清以备后期实验用。选取30例KOA患者,随机分为空白对照组、模型对照组、Compound C阻断剂组、Compound C阻断剂+最佳HQC含药血清浓度组、最佳HQC含药血清浓度5组,提取各组外周血单个核细胞(PBMC)进行培养。用MTT法检测不同浓度HQC含药血清培养12、24、48h后的PBMC抑制率,选取最佳含药血清浓度和最佳作用时间;用ELISA法检测细胞培养液中白细胞介素1β(IL-1β)、IL-4、过氧化脂质(LPO)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、总抗氧化能力(TAOC);RT-PCR检测各组PPARγ、AMPKα1、FoxO3a、MnSODmRNA的表达;Western-blot检测各组PPARγ、AMPKα1、p-AMPKα1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白的表达。3结果3.1数据挖掘结果3.1.1 1904例湿热型KOA患者血清SOD值下降的有1215例(占64%),相关性分析显示SOD与ESR、hs-CRP、TG、IgG呈负相关,与HDL-C呈正相关(P<0.05或P<0.01)。Logistic回归分析显示,ESR、hs-CRP、IGG、TG、LDL-C、APO-B是影响KOA患者SOD水平的独立危险因素。中药薏苡仁、蒲公英、豨莶草与SOD上升关联度较高。3.1.2 1904张处方以清热解毒、健脾化湿、活血通络、祛风除湿4类药为主。蒲公英、丹参、薏苡仁、威灵仙、桃仁、红花、茯苓、山药、陈皮、甘草是湿热证KOA的核心处方。治疗骨关节炎常用的配伍组合有桃仁、红花,蒲公英、白花蛇舌草,黄柏、黄芩、紫花地丁,透骨草、伸筋草。3.1.3内外合治组治疗后ESR、hs-CRP、IgG水平降低较单纯内治组治疗后降低明显,且在提高SOD水平方面明显优于单纯内治组(P<0.05或P<0.01),差异有统计学意义。两组hs-CRP、ESR、补体C3、补体C4随机行走模型评价得出,内外合治组在随机波动最大值、行走正向增长率、综合评价指标递增率、综合改善率、综合评价指标记录次数、期望改善值等方面均优于单纯内治组。而且内外合治组ESR、hs-CRP的随机波动幂律值均小于0.5,提示患者的炎症指标ESR、hs-CRP的变化和患者接受的干预措施存在长程关联。3.2临床研究结果3.2.1 KOA患者外周血中氧化应激指标的变化检测60例KOA患者及20例正常健康人外周血中氧化应激相关指标,KOA组SOD、TAOC明显降低,MDA、LPO水平显著升高(P<0.05,P<0.01)。异常例数分别为45、42、36、28,分别占75%、72%、60%、46.7%。3.2.2 KOA患者外周血细胞因子、AMPK-FoxO3a-MnSOD、CD36的变化与20例正常健康人相比,60例KOA患者血清IL-1β、IL-6、TNF-α明显升高(P<0.05),IL-4、IL-10、IL-9、TGF-β、CD36、PPARγ、AMPKα1、p-AMPKα1、FoxO3a、p-FOXO3a、MnSOD则明显降低(P<0.05)。且KOA组外周血CD36相对荧光强度明显下降(P<0.01)。3.2.3 KOA患者氧化应激指标的相关性分析相关性显示:SOD与IL-9、TGF-β、AMPKα1、p-AMPKα1、FoxO3a、KSS功能评分成正相关,与IL-1β、TNF-α、湿热症候积分、症状量化积分、WOMAC、ISOA、VAS成负相关;TAOC与IL-9、CD36、AMPKα1、FoxO3a、p-FOXO3a、MnSOD、KSS临床评分成正相关,与IL-1β、TNF-α、湿热症候积分、症状量化积分、WOMAC成负相关;MDA与IL-1β、IL-6、湿热症候积分、WOMAC、ISOA、KSS临床评分、VAS成正相关,与IL-10、CD36、PPARγ、p-AMPKα1、MnSOD、KSS功能评分成负相关;LPO与IL-4、IL-10、IL-9、TGF-β、CD36、PPARγ、AMPKα1、p-AMPKα1、p-FOXO3a、MnSOD、KSS功能评分成负相关,与IL-6、症状量化积分、VAS成正相关(P<0.05,P<0.01)。3.2.4健脾化湿清热通络组治疗KOA患者的临床疗效治疗后,对照组与研究组总有效率分别为83.3%、90%,两者比较无统计学意义(P>0.05);研究组显效率(50%)显著高于对照组(30%)(P<0.05)。3.2.5健脾化湿清热通络组对KOA患者外周血氧化应激指标的影响与治疗前相比,研究组治疗后SOD、TAOC明显升高,MDA、LPO明显降低(P<0.01;P<0.01),对照组治疗后SOD、TAOC明显升高,LPO下降(P<0.01;P<0.05)。与对照组治疗后相比,研究组SOD、TAOC明显升高,MDA、LPO明显降低(P<0.05或P<0.01)。3.2.6健脾化湿清热通络组对KOA患者外周血细胞因子、AMPK-FoxO3a-MnSOD、CD36的影响与治疗前相比,研究组IL-4、IL-10、IL-9、TGF-β、CD36、PPARγ、AMPK、p-AMPK、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD明显升高,IL-1β、IL-6、TNF-α明显下降,对照组IL-10、TGF-β升高,IL-1β、IL-6明显降低(P<0.05);与对照组相比,IL-4、IL-10、IL-9、TGF-β、CD36、PPARγ、AMPK、p-AMPK、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD明显升高,IL-1β、TNF-α明显下降(P<0.05或P<0.01)。且研究组CD36相对荧光强度较对照组明显升高(P<0.01)。3.2.7健脾化湿清热通络组对KOA患者疾病活动性指标的影响两组治疗后,研究组ESR、hs-CRP、IgG较对照组改善明显(P<0.05)。3.2.8健脾化湿清热通络组对KOA患者生活质量的影响与治疗前相比,研究组治疗后生活质量明显改善(P<0.05),与对照组比较,研究组总体健康、情感职能、躯体疼痛、心理健康明显优于对照组(P<0.05)。3.2.9健脾化湿清热通络组对KOA患者湿热症候积分、症状量化积分、ISOA、WOMAC、KSS积分及VSA评分的影响与治疗前相比,研究组症状量化积分、湿热证候积分、ISOA、WOMAC积分明显降低,KSS临床评分显著升高(P<0.05,P<0.01)。与对照组比较,研究组在降低症状量化积分、湿热证候积分、VAS、WOMAC、VAS评分,升高KSS临床评分方面明显优于对照组3.3实验研究结果3.3.1黄芩清热除痹胶囊对人外周血单核细胞细胞因子的影响与正常对照组相比,模型对照组、Compound C组、Compound C+最佳浓度HQC组IL-1β均上升,IL-4均下降(P<0.01或P<0.05);与最佳浓度HQC相比,CompoundC组和模型对照组IL-1β均明显上升,IL-4均明显下降(P<0.01);Compound C+最佳浓度HQC组IL-4下降(P<0.05)。3.3.2黄芩清热除痹胶囊对人外周血单核细胞氧化应激指标的影响与正常对照组相比,模型对照组、Compound C组、Compound C+最佳浓度HQC组SOD、TAOC水平下降,MDA、LPO水平上升(P<0.01或P<0.05);与最佳浓度HQC相比,Compound C+最佳浓度HQC组、Compound C组和模型对照组SOD水平均下降,Compound C组TAOC下降,Compound C+最佳浓度HQC组、Compound C组和模型对照组MDA、LPO均上升(P<0.05或P<0.01)。3.3.3黄芩清热除痹胶囊对人外周血单核细胞AMPK-FoxO3a-MnSOD通路指标的影响与正常对照组相比,模型对照组、Compound C组PPARγmRNA、MnSOD mRNA、PPARγ、p-AMPKα1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白水平下降(P<0.05),模型对照组、Compound C组、Compound C+最佳浓度HQC组AMPKα1 mRNA、FoxO3a mRNA、AMPKα1蛋白表达水平下降(P<0.05);与最佳浓度HQC组比较,Compound C+最佳浓度HQC组PPARγmRNA、MnSOD mRNA、PPARγ、FoxO3a、p-FoxO3a和MnSOD蛋白水平下降,Compound C组PPARγmRNA、AMPKα1 mRNA、FoxO3a mRNA、MnSOD mRNA、PPARγ、AMPKα1、p-AMPKα1、FoxO3a、p-FoxO3a、MnSOD蛋白表达均下降,模型对照组PPARγmRNA、FoxO3a mRNA、MnSOD mRNA、PPARγ、AMPKα1、p-FoxO3a、MnSOD蛋白表达下降(P<0.05或P<0.01)。4结论4.1 KOA患者存在氧化应激,表现为抗氧化酶SOD、TAOC水平降低,脂质过氧化酶MDA、LPO水平升高。4.2 KOA患者氧化应激相关指标的改变与细胞因子的失衡,以及AMPK-FoxO3a-MnSOD通路相关,并与临床症状评价、生活质量和实验室指标相关。4.3健脾化湿清热通络法在改善KOA患者的临床症状同时,还能够显著改善KOA患者的氧化状态及免疫炎症状态,且临床疗效、量表评分和临床症状评分等均优于氨基葡萄糖组。4.4健脾化湿清热通络法改善KOA氧化应激状态的机制4.4.1上调抑炎因子,下调致炎因子,阻止其对氧化和抗氧化系统的影响,及其对软骨细胞的破坏;4.4.2上调抗氧化酶SOD、TAOC,下调脂质过氧化物MDA、LPO,活化AMPK-FoxO3a-MnSOD信号的表达,阻止氧化-抗氧化系统及促-抗炎性反应体系紊乱,发挥抗氧化作用,减少对成骨细胞的损害。