背景及目的　　 P190蛋白是一种神经元跨膜蛋白,由1384个氨基酸组成。最初发现于有髓神经纤维郎飞氏节的节旁侧,主要在脊椎动物脑内表达,另外在卵巢、胰脏、肠、肺、心脏及睾丸等组织内也有少量表达。P190蛋白与髓鞘蛋白NF155等结合,在神经轴突的节旁侧形成节旁连接(paranodal junction),这种连接结构类似于间隔连接(septate junction)。间隔连接广泛存在于果蝇等无脊椎动物的血-神经屏障处,与脊椎动物血脑屏障处的紧密连接功能类似。目前研究表明,脊椎动物内由P190、NF155等蛋白形成的节旁连接在维持神经冲动的跳跃式传导、轴突-胶质细胞间信息快速传递、轴突特化区域的形成及轴-胶间隙与细胞外基质间屏障形成中发挥重要作用。P190蛋白表达异常可产生严重的神经系统功能紊乱,P190-/-型小鼠的神经冲动传导速度明显低于正常小鼠,而且在出生后不久即因神经元变性坏死而导致死亡。另外有研究显示多发性硬化症(multiple sclerosis,MS)患者脑内P190表达水平明显降低。P190表达降低可进一步导致髓鞘脱离轴突,促进轴突变性坏死,进而形成神经元变性损伤的恶性循环。在糖尿病性神经病变的大鼠中,P190的表达水平也明显降低。由此可见,P190蛋白的功能是至关重要的,但其具体功能和作用机制还不清楚。　　 血脑屏障(blood-brainbarrier,BBB)是由脑微血管内皮细胞、星型胶质细胞、基膜及周细胞等共同组成的高度特化的神经血管结构单元。其中脑微血管内皮细胞间的紧密连接和粘附连接是构成血脑屏障结构的基础,也是维持血脑屏障功能的关键。目前已知的内皮细胞间连接相关蛋白已有很多,包括跨膜蛋白和细胞内的衔接蛋白;同时对内皮细胞间紧密连接和粘附连接的作用机制也有了深入认识,但仍有待发现更多的连接蛋白及更深入的了解内皮细胞屏障功能机制。　　 我室研究人员发现P190蛋白除了在神经轴突有表达外,在人脑微血管内皮细胞(HBMEC)内也有大量表达。基于此,本研究通过利用酵母双杂交的方法,筛选与P190的胞外段蛋白互作的蛋白,期望找出P190对内皮细胞功能作用的机制。　　 方法　　 1、酵母双杂交法筛选P190结构域(812aa-1250aa)的相互作用蛋白。　　 2、在酵母中再验证P190结构域(812aa-1250aa)与cystatinC的相互作用。　　 3、P190结构域(812aa-1250aa)表达载体的构建。　　 4、GST-cystatinC融合蛋白的表达和纯化。　　 5、利用GST-pulldown实验验证P190结构域(812aa-1250aa)与cystatinc相互作用。　　 6、利用脂质体共转染和免疫共沉淀方法实验验证P190结构域(812aa-1250aa)与cystatinC相互作用。　　 7、免疫共沉淀方法实验验证P190结构域(812aa-1250aa)与cystatinc相互作用。　　 8、脂质体法转染。　　 9、蛋白质免疫印迹(Western-blot)。　　 10、免疫细胞化学实验。　　 结果　　 1、酵母双杂交方法筛选出P190结构域(812aa-1250aa)的相互作用蛋白cystatinC。　　 2、酵母共转验证方法验证P190结构域(812aa-1250aa)与cystatinc相互作用。　　 3、在293T细胞中验证cystatinc和P190结构域存在相互作用。　　 (1)免疫沉淀(IP)验证cystatinc与p190相互作用。　　 (2)免疫荧光共聚焦结果。　　 4、在人脑为血管内皮细胞(HBMEC)中验证cystatinc和P190结构域存在相互作用。　　 (1)GST-pulldown证实cystatinc和P190结构域可相互结合。　　 (2)在人脑微血管内皮细胞(HBMEC)中验证没有cystatinc的存在。获得高表达P190结构域(812aa-1250aa)蛋白的HBMEC细胞株。　　 结论　　 cystatinc可能与P190互相作用,cystatinc可能是P190的配体。Cystatinc与P190互作的生物学意义有待于进一步的研究。