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刚地弓形虫(Toxoplasmagondii)是一种呈世界性分布的专性细胞内寄生原虫,能引起人兽共患寄生虫病。动物感染弓形虫十分普遍,其中猫科动物是弓形虫的唯一终末宿主,在弓形虫的生活史以及弓形虫在宿主间的流行中扮演至关重要的角色。动物多数为隐性感染,但猪感染后不仅可引起发病和死亡,而且是人体感染的重要传染源。在我国猪弓形虫病发现于上世纪七十年代,曾引起猪的大批死亡,给养猪业造成严重危害。近年来尽管猪弓形虫病的临床病例报道较少,但对屠宰猪和养殖场猪群的流行病学调查显示,目前弓形虫在我国的猪群中的感染率仍然很高。弓形虫存在不同的基因型,而Chinese I型是感染我国人体和动物弓形虫的优势基因型。本文对就诊于扬州大学动物医院的临床病死猪以及流浪猫进行了弓形虫病的流行病学调查,并用分离于病死猪的Chinese I型虫株以3种方式感染仔猪,观察感染猪的临床症状及免疫病理变化,并基于高通量测序技术自MicroRNA水平对弓形虫与宿主间的互作进行了初步分析和研究。1.动物弓形虫病分子流行病学调查及虫株遗传多样性分析2011年9月～2016年8月间共采集139个病死猪的组织以及64例流浪猫的组织和血液,分别采用PCR和ELISA方法检测弓形虫DNA或抗弓形虫特异性抗体,并采用PCR-RFLP技术对阳性组织的弓形虫DNA中10个遗传标记位点进行基因型鉴定。结果显示,病死猪的弓形虫阳性率为46.04%,猪日龄及地理位置是猪弓形虫病诱发的风险因素。检测的610份病死猪组织样品中,弓形虫检出率29.84%,其中肺脏和心脏弓形虫检出率显著更高(P<0.05)。64例流浪猫,组织PCR检测和血清特异性IgG抗体检测的弓形虫阳性率分别为17.19%和25.00%,总阳性率为34.38%。对阳性样品基因分型,共鉴定出22株弓形虫分离株,包括6种不同的基因型,分别为ToxoDB#9(Chinese Ⅰ)型、ToxoDB#10(Type I)型、ToxoDB#213型、ToxoDB#89型以及2种新基因型。ToxoDB#89型及2种新基因型虫株属中国首次报道,ToxoDB#9型为江苏地区动物感染弓形虫的优势基因型,显示该地区动物感染弓形虫具有有限的遗传多样性。2.人源和猪源弓形虫分离株的基因型与毒力分析优化弓形虫速殖子的纯化方法,获得纯净的弓形虫速殖子后,应用PCR-RFLP方法对人源(KS)及猪源(YZ-1、YZ-2)弓形虫分离株的10个遗传标记位点进行基因型鉴定,并分别以104、103、102、101、100个速殖子的剂量经腹腔感染ICR小鼠,统计其死亡率与平均成活时间,以评判3个分离株的小鼠毒力。随后,对3个弓形虫毒力相关因子进行克隆及序列分析。结果显示,KS分离株为Ⅰ(ToxoDB#10)型,YZ-1和YZ-2分离株为ChineseⅠ(ToxoDB#9)型;小鼠毒力试验显示3分离株均为鼠强毒株;与KS分离株和RH株比较,YZ-1和YZ-2分离株在GRA6基因存在2个片段(15bp、3bp)的缺失;3个分离株在KHB片段均存在Pvu Ⅱ酶切位点;在SAG1基因5’UTR区上游均存在5个27 bp的串联重复序列,均与弓形虫毒力相关。这些数据显示Chinese Ⅰ型虫株毒力的分子基础可能与Ⅰ型毒株不同,且在毒力相关基因中有其自身特征。3.Chinese Ⅰ型弓形虫分离株感染仔猪病理学特征研究用Chinese Ⅰ型弓形虫YZ-1株速殖子,分别经静脉注射、腹腔注射和饲喂小鼠的途径接种健康仔猪,同时设不感染对照组。感染后每天观察感染猪的临床表现,并进行直肠体温检测,分别在攻虫后第10、25、50、80天对各组仔猪随机选择进行剖杀剖检,观察眼观病变,并制作组织切片,观察病理组织学变化。同时,取部分猪组织用于小鼠生物鉴定,以及提取DNA后进行PCR检测。结果显示,3种感染方式均能感染仔猪,并引起仔猪发病;各组感染仔猪均产生不同程度的临床症状,如高热、体重下降以及气喘、咳嗽、拉稀、发绀等,并发生急性死亡;剖检发现急性期主要病变发生于肺、肝、脾以及淋巴结组织等,慢性期病变不明显;组织病理学观察发现,急性期的猪肺脏、脾脏、肝脏、淋巴结以及肠道组织有不同程度的出血、坏死等,慢性期则主要为脑膜炎症及肺泡气肿等;感染后第50天在猪脑组织中发现组织包囊,但第80天时组织包囊又消失,且用脑组织进行PCR检测和鼠生物鉴定均为阴性。这些发现表明ChineseI型强毒株尽管不能在小鼠体内建立慢性感染,但可在仔猪脑内形成组织包囊,但形成的包囊并不能长期存在。4.弓形虫感染仔猪免疫相关指标的变化健康仔猪接种Chinese Ⅰ型弓形虫YZ-1株速殖子后,按第1周4次、第2～4周每周2次、第5周始每周1次的频率采集各组仔猪血液,用建立的荧光定量PCR方法对各组仔猪的血液DNA进行检测,并应用ELISA方法评价仔猪的细胞免疫和体液免疫水平。结果显示,建立的荧光定量PCR检测方法灵敏性高,适合用于临床诊断;各组仔猪血液中带虫数量及持续带虫时间不尽一致;在静脉注射组和腹腔注射组的感染初期,血清IFN-γ和IL-12(Th1型细胞因子)浓度显著升高(P<0.05),其中IL-12最早发挥作用,与饲喂小鼠组相一致;IL-10和IL-4(Th2型细胞因子)血清浓度变化不一致,饲喂小鼠组的IL-10水平较静脉注射组和腹腔注射组的显著升高(P<0.05)且出现早,而血清IL-4浓度在各组仔猪间整体曲线起伏变化均较小;仔猪血清中IgM抗体出现早,IgG抗体浓度则在感染后7～14天开始显著增高(P<0.05),并持续相对较长的时间。这些结果表明弓形虫感染后Th1型细胞因子率先上调表达,以激活机体细胞免疫应答,而Th2型免疫调节性细胞因子则在机体免疫损伤保护及刺激机体产生相应抗弓形虫抗体中发挥作用。5.弓形虫急性与慢性感染对仔猪脾脏miRNA表达的影响健康仔猪经静脉注射Chinese Ⅰ型弓形虫YZ-1株速殖子后,分别采集急性(感染后10 d)和慢性感染期(感染后25 d)的仔猪脾脏组织,提取总RNA,质检合格后Small RNA建库,高通量测序,再经数据筛选、基因组比对、分类注释,比较已知和预测的miRNA的差异表达并对其靶基因进行GO与KEGG富集分析。结果显示,比较感染和未感染仔猪脾脏组织,共有38个miRNA表达显著差异。急性感染阶段,共有35个miRNA表达显著差异,其中22个呈上调,13个下调表达;慢性感染中,6个miRNA表达差异显著,其中4个上调,2个miRNA下调表达;差异表达的miRNA主要通过对Toll样受体信号通路相关基因表达、细胞因子受体及STAT家族成员的调控,来影响弓形虫感染仔猪后的免疫水平。6.弓形虫急性与慢性感染对仔猪脑组织miRNA表达的影响健康仔猪经静脉注射Chinese Ⅰ型弓形虫YZ-1株速殖子后,分别采集急性(感染后10 d)和慢性感染期(感染后25 d)的仔猪脑组织,提取总RNA,随后按研究脾脏的方法分析脑组织miRNA表达的变化。对比感染和未感染仔猪脑组织,急性感染时期共有89个miRNA表达呈现显著差异,其中51个呈上调表达,38个下调表达;而慢性感染时期,69个miRNA表达呈显著差异,32个miRNA上调表达,37个下调表达。急性期miRNA主要与免疫相关,慢性期miRNA主要参与肿瘤机制及神经发育调节。