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目的:观察BMSCs来源外泌体(BMSCs-Exo)和Runx2转染BMSCs来源外泌体(R-BMSCs-Exo)对软骨细胞增殖、迁移和表型维持的影响,并进一步探寻影响软骨细胞增殖、迁移和表型维持的调节蛋白,以期为软骨损伤患者的临床治疗提供分子生物学依据。方法:1.体外分离提取的BMSCs经荧光倒置显微镜观察,成骨、成脂诱导后染色及流式细胞技术进行鉴定;体外分离的软骨细胞经荧光倒置显微镜观察,吖啶橙、甲苯胺蓝和二型胶原免疫荧光染色进行鉴定。2.我们前期的实验已确定Runx2腺病毒(Ad-Runx2)的转染效率和最佳转染浓度,本研究直接采用。3.YAP-si RNA筛选后进行作用浓度和时间摸索以确定最佳抑制效果。4.体外正常培养的兔BMSCs,取第三代(P3)细胞分为单纯细胞组和Runx2转染组进行扩大培养。贴壁后更换无外泌体培养基,待培养结束后收取细胞上清液以超速离心法提取外泌体备用,并进行透射电镜、表面标志物、NTA鉴定和浓度测量。5.体外正常培养的兔膝关节软骨细胞取P2代种板,待细胞密度达到70%时分别加入不同浓度(0、1、5、10)μg/m L的外泌体,检测Col-II、SOX9、Aggrecan等表型基因和蛋白的表达情况(此过程BMSCs-Exo和R-BMSCs-Exo独立完成并对比两者峰值时的表达差异),此外用CCK-8和Transwell实验观察BMSCs-Exo和R-BMSCs-Exo峰值时的细胞增殖和迁移水平。6.P2代软骨细胞种板后转染外泌体,观察YAP及其靶基因Ankrd1和CTGF的m RNA、蛋白表达情况。7.用si RNA沉默YAP后转染外泌体到软骨细胞,观察YAP沉默前后软骨细胞增殖、迁移和表型的表达差异,以此判断外泌体是否通过影响YAP来发挥作用。结果:1.经倒置显微镜观察,细胞形态呈典型长梭状、纺锤形,克隆生长呈漩涡排列。成骨诱导后,茜素红染色可见大量矿化结节;成脂诱导后,油红O染色可见大量脂滴。FCM结果显示,高表达CD44、CD29,低表达CD45,分离培养的确为BMSCs。2.软骨细胞镜下12 h后开始贴壁,24 h开始铺伸,5 d后细胞融合成片,如“铺路石”状。甲苯胺蓝染色显示,软骨细胞单层生长,呈三角形或者多边形,细胞质染为蓝紫色;吖啶橙荧光染色显示,软骨细胞核呈清晰绿色荧光;COL-Ⅱ免疫荧光染色显示细胞质为蓝色,核为红色,体外分离培养的确为软骨细胞。3.外泌体经NTA分析,其粒径分布大多在30-150 nm之间,形态呈“半球形”或“茶托状”,富含CD63、CD81和TSG101等外泌体表面标志物,证实外泌体被成功分离。PKH26染色外泌体后与软骨细胞共孵育6 h,DAPI染色细胞核,观察到细胞核周围有被标记的外泌体,标志外泌体成功内化到软骨细胞。4.对YAP-si RNA三条序列进行筛选,si RNA-2抑制作用最为明显,对si RNA-2作用浓度进行检测,发现在40 nmol/L浓度下抑制效果较好,对si RNA-2作用时间进行检测可知,连续作用48 h可以将抑制效果发挥到最佳,后续实验选用si RNA-2在40 nmol/L的浓度下连续作用48 h以沉默YAP。5.不同浓度外泌体对软骨细胞m RNA、蛋白表达的影响。1)BMSCs-Exo按照0、1、5、10μg/m L的浓度转染到软骨细胞。结果显示,COL-Ⅱ、Aggrecan和SOX9都随浓度的增大呈上升趋势。其中SOX9显著升高,Aggrecan和COL-Ⅱ在较高浓度(10μg/m L)升高明显(P<0.05或P<0.01)。根据WB可知,Aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9呈浓度依赖趋势表达量依次增加。与0μg/m L比较,SOX9和Aggrecan明显升高(P<0.05或P<0.01),COL-Ⅱ除低浓度(1μg/m L)外显著升高(P<0.01)。2)R-BMSCs-Exo按照0、1、5、10μg/m L的浓度转染到软骨细胞。结果显示,除SOX9以外,Aggrecan和COL-Ⅱ都随着浓度增大呈递增趋势。Aggrecan和COL-Ⅱ升高显著(P<0.01);SOX9在较高浓度(10μg/m L)升高明显(P<0.05)。根据WB检测可知,Aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9呈浓度依赖趋势表达量依次增加。COL-Ⅱ升高显著(P<0.01);Aggrecan和SOX9除低浓度(1μg/m L)外,表达量明显升高(P<0.05或P<0.01)。3)对比BMSCs-Exo(E-10)和R-BMSCs-Exo(RE-10)在10μg/m L时的m RNA表达量得出,Aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9与0μg/m L相比,E-10变化不明显,RE-10变化显著(P<0.05或P<0.01)。SOX9与E-10比较,RE-10显著升高(P<0.05)。据WB可知,Aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9在0、E-10和RE-10的蛋白表达呈递增趋势。与0μg/m L相比,E-10和RE-10在Aggrecan和COL-Ⅱ明显升高(P<0.05或P<0.01)。SOX9在RE-10升高明显(P<0.01)。6.不同浓度外泌体对软骨细胞增殖和迁移的影响。1)CCK-8检测软骨细胞在0、E-10和RE-10时细胞增殖可知,与0μg/m L相比,E-10细胞增殖能力增强(P<0.05);RE-10细胞增殖显著,处于对数增长期(P<0.01)。与E-10比较,RE-10细胞增殖明显(P<0.05)。前述可知,E-10和RE-10都可以促进软骨细胞增殖,相比RE-10效果更好。2)Transwell检测软骨细胞在0、E-10和RE-10时细胞迁移可知,与0μg/m L相比,E-10细胞迁移能力明显增强(P<0.05);RE-10细胞迁移能力显著提高(P<0.01)。与E-10比较,RE-10细胞迁移能力明显提高(P<0.05)。前述可知,E-10和RE-10都可以促进软骨细胞迁移,相比RE-10效果更好。7.对YAP及其靶基因Ankrd1、CTGF的m RNA检测发现,在0、E-10和RE-10的表达呈增长趋势。与0μg/m L相比,三者E-10均表达升高,但无统计学差异;RE-10升高显著(P<0.05)。与E-10比较,CTGF升高明显(P<0.05)。据WB可知,与0μg/m L相比,YAP、Ankrd1和CTGF在E-10和RE-10升高显著(P<0.05或P<0.01);与E-10比较,RE-10表达量升高,但差异不明显(P>0.05)。前述可知,BMSCs-Exo和R-BMSCs-Exo均可促进YAP及其靶基因Ankrd1、CTGF表达,RE-10效果更佳。8.用si RNA沉默YAP后,他的靶基因Ankrd1和CTGF也被明显抑制(P<0.05),同时细胞表型相关基因Aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9表达量也显著降低(P<0.05或P<0.01),说明细胞的分裂增殖被明显抑制,YAP可以直接促进细胞增殖相关基因的表达。当YAP被沉默后再用外泌体进行干预,YAP及其靶基因CTGF、Ankrd1的表达和增殖、表型相关基因Aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9的表达量均显著减少(P<0.05或P<0.01),证明外泌体促进Aggrecan、COL-Ⅱ和SOX9基因表达的作用被沉默的YAP抑制了。WB结果说明同样问题。9.用si RNA沉默YAP后,外泌体对软骨细胞增殖和迁移的影响。1)用CCK-8检测各组数值,结果说明,YAP-si RNA明显抑制了软骨细胞增殖(P<0.05);当YAP被沉默后再用外泌体进行干预,其增殖效果显著降低(P<0.01)。外泌体促进软骨细胞增殖是通过上调YAP来实现的。2)Transwell迁移实验证实,YAP被沉默后软骨细胞的迁移显著下降(P<0.05);当YAP被沉默后再用外泌体进行干预,其迁移效果显著低于单纯的外泌体(P<0.01)。前述可知,外泌体是通过上调YAP来促进软骨细胞迁移。结论:1.BMSCs-Exo和R-BMSCs-Exo均可以促进软骨细胞增殖、迁移和表型维持,其效果R-BMSCs-Exo更强。2.外泌体通过上调YAP进而促进软骨细胞增殖、迁移和表型维持。