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类固醇激素是一类非极性的小分子甾体激素,它们可以通过内分泌系统来调节体内代谢过程,临床类固醇激素的检测从一次最多能检测5种类固醇激素的放射性免疫分析法发展到能够自动化检测的直接免疫分析法。这些方法有操作比较简单,检测时间较短等优点,所以该方法是多数临床实验室筛查激素的常用方法。但是由于免疫分析法有交叉干扰,基质干扰,低通量等问题,已经不能满足现代临床激素检测的需求。随后,液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术检测激素的研究和应用的报道逐渐增加,直到发展成为检测类固醇激素的“金标准”。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)是超高灵敏度的高效分离检测系统,即通过高效液相色谱高分辨的分离能力将混合物中的组分分离开来,并且用质谱仪来进行定量,定性分析。液相色谱-串联质谱技术可以一次检测很多种类固醇激素,并且该方法前处理简单,检测速度快,准确性高,由于有同位素内标的校准,色谱和质谱的双重分离效果,其基质效应已经大大的降低,假阳性结果的出现也变得微乎极微。目前在中国,色谱及质谱技术在临床上的应用还处于起步阶段,液质联用技术亟待进一步地开发应用,以满足临床检测和疾病诊断的需求。为了研究不同前处理方法对类固醇激素灵敏度的影响,我们比较了直接液-液萃取和液-液萃取后再衍生化对定量限的影响并且运用高效液相色谱-电喷雾电离-四级杆-时间飞行仪质谱法(HPLC-ESI-Q-TOF)完成了对人体血清中10种类固醇激素定量的方法学开发和验证。前处理上采用衍生化和液-液萃取的方法,得到了不衍生化直接液-液萃取,离子信号响应提高2倍到200多倍的结果,优化了羟胺溶液与10种类固醇激素的衍生化时间和温度,得到了最低0.05 ng/m L的定量限,优化了液相色谱条件,使得总的样本检测时间控制在5.7 min以内,基本满足人体血清中类固醇激素的检测。由于上述方法最低定量限还不能完全满足人体激素的检测,为了能够进一步降低方法的灵敏度,我们运用超高液相色谱-电喷雾电离-三重四极杆质谱(UPLC-ESI-QQQ)法,实现了人体血清中18种类固醇激素的定量检测。前处理方法中直接采用成本低廉,花费时间相对于离线固相萃取或者衍生化方法少的液-液萃取的方法,在没有降低灵敏度(最低检测定量限7 pg/m L)的前提下使得整个前处理时间控制在10 min以内,仪器检测时间在6 min以内,并且此方法在检测激素数量上超过了现有的文献报道。该方法的线性,日内日间精密度,基质效应,准确性,稳定性等均达到美国FDA生物样本检测指南的要求,另外在该章中共完成了78例疑似患者样本检测,并且成功检测出了53例患者与先天性肾上腺皮质增生患者临床表型相同,即确诊为先天性肾上腺皮质增生患者。另外,我们也对人体尿液中20种类固醇激素及其代谢物进行了UPLC-ESI-QQQ质谱法定量分析。在尿液的类固醇激素的检测中我们所用样本体积小(190μL),优化了酶解所用酶量,液-液萃取所用的溶剂,在酶解和液-液萃取的前处理后其最低定量限仍然可以低达5 pg/m L。并且该方法的线性,日内日间精密度,准确性,稳定性等也均达到美国FDA生物样本检测指南的要求。此外,我们不仅检测了人体尿液中主要代谢转化途径的17种激素,还首次用UPLC-ESI-QQQ法定量检测了孕三烯酮,肾上腺酮,11β-羟雄酮三种类固醇激素,这些激素对于肾上腺皮质增生症的诊断与治疗有着重要的意义。总之本文所建立和验证的方法能够快速,准确,灵敏的同时检测人体血液和尿液中18-20种类固醇激素,包括孕激素,雄激素,糖皮质激素,盐皮质激素,雌激素等五大类,并且所建立的方法在本实验室中能够应用于先天性肾上腺皮质(CAH)增生症患者的检测与治疗。此外,库欣综合症,多囊卵巢综合症,急性或者慢性肾上腺皮质功能减退,系统性红斑狼疮等疾病都属于临床类固醇激素检测的应用范围,类固醇激素的LC-MS/MS定量分析为上述相关疾病的诊断和治疗提供了科学的实验数据和分析方法。