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目的:胰淀素(Amylin)是2型糖尿病动物模型和患者胰岛组织中发现的淀粉样蛋白沉积物的主要成分,为胰岛β细胞的正常分泌产物。临床病理发现,胰岛细胞(主要是β细胞)被胰岛淀粉样蛋白取代的程度是糖尿病疾病过程严重程度的一个决定因素,表明胰淀素在2型糖尿病的发生、发展中起重要作用。目前对胰淀素的生物功能研究还不完全清楚,尤其是关于胰淀素作用后所导致的细胞超微结构生物功能改变及对胰岛素(Ins)分泌调控影响的研究较少见,本实验应用体外培养的新生SD大鼠胰岛单层细胞,从Ins分泌、细胞内DNA和Ins含量变化、膜电位(MP)和细胞内游离Ca2+浓度([Ca2+]i)、pH、活性氧(ROS)、线粒体含量等信号变化的角度初步探讨胰淀素对胰岛细胞生物功能影响的机制。 方法:1、应用体外单层培养的新生SD大鼠胰岛细胞,以放射免疫双抗体法、紫外分光光度法检测不同浓度胰淀素对Ins分泌以及胰岛细胞内Ins、DNA含量变化。2、采用粘附细胞仪(ACAS570细胞仪)和MTT比色分析法,检测10μmol/L胰淀素孵育2小时后,胰岛β细胞内pH、ROS及线粒体活性的变化。3、利用敏感、特异的荧光探针和激光扫描共聚焦显微镜,检测了不同浓度胰淀素作用下,胰岛β细胞[Ca2+]i、MP的变化。并进一步以10μmol/L胰淀素预先孵育培养细胞2小时后,设立Ca2+通道阻断剂组、鸟苷酸环化酶抑制剂组,观察其对16.7mmol/L葡萄糖作用后的[Ca2+]i变化机理。 结果:1、不同浓度胰淀素孵育2小时对胰岛细胞Ins的基础分泌量无明显影响;高浓度的胰淀素(10μmol/L以上)可抑制高糖刺激下的Ins分泌(P<0.01),并呈剂量依赖性,而低浓度胰淀素(10μmol/L以下)对Ins释放无明显影响。同时,胰淀素孵育后,胰岛β细胞内DNA、Ins含量在高浓度组明显升高,与正常对照组相比差异非常显著(P<0.01),而低浓度组与对照组相比无明显差异。2、10μmol/L胰淀素作用后,细胞内pH升高,胞浆碱化明显;胰岛β细胞内ROS生成增多;线粒体活性在1.5小时开始明显降低,相差显微镜下观察,胰淀素作用二刁时后可见声分刽胞胞体缩*歹 月浆发《空泡变性歹 少数叁胞核问 纵裂8凡 胞膜突起呈出胞现象。3、高浓度胰淀素孵育后胰岛 6细胞Ka’”];荧光值明显高于正常对照组(P<O.版),而MP荧光强度降低(P<0.“),细胞膜内外电位差增大,表明*a’”];是增高的,细胞膜出现超极化。在16.7**d几葡萄糖刺激后,高浓度胰淀素组*于*的升高受到抑制,KaZ】荧光值的增高较正常对照组为低叩<0刀引,员细胞膜呈现持续超极化改变:而低浓度胰淀素孵育后Ky];荧光值、*P变化与正常对照组相比无显著改变 u均>0.0引。高浓度胰淀素作用的p细胞加入外钙阻断剂维拉帕米后,在 16.7mmol/L葡萄糖刺激下,*a’*荧光强度增高,但升高的幅度降低,与未阻断前相比有显著性差异(厂<0.仍卜 给予乌背酸环化酶抑制剂亚甲蓝处理后,细胞*扩*荧光强度明显升高,与亚甲蓝作用前相比变化明显叩<0.01),表现Zk-定程度的抑制作用。 结论:本研究结果初步表明:1、胰淀素对体外培养胰岛细胞的分泌功能有明显影响。高浓度胰淀素明显抑制高糖刺激下的胰岛p细胞1ns分泌,而胰岛日细胞内 **A、胰岛素含量明显升高。其主要电生理改变是抑制了胰岛6细胞*扩”1;的升高,6细胞膜呈现持续超极化改变,从汀使细胞功自处于于制状态,抑制p细胞分泌Ins。2、[Ca’】变化尹十门能主要与高浓度腴淀素抑制细胞外钙进入胞浆并使细胞内卅受仰敏感钙池释放钙离子受抑制有关。3、高浓度胰淀素作用后光镜下见部分细胞受损的形态学改变,线粒体活性降低,表明胰淀素对胰岛细胞的活力有直接抑制作用,呈明显浓度、时间依赖性;胰岛p细胞胞浆碱化可能与细胞损伤的发生相关;细胞内 **S 的生成增多,推测胰淀素可能与糖尿病井发症的发生有关。