原发性先天性青光眼(primary congenital glaucoma,PCG)是胚胎发育异常,房角结构变异引起房水流出障碍的一类遗传性眼病。PCG患者通常表现出畏光、溢泪、眼睑痉挛、眼压增高等症状,最终引起视神经萎缩等不良后果,影响患者的生存质量。多数PCG患者在出生时就伴随眼部异常。迄今,PCG的确切发病机理尚待阐明,亦缺乏高效的干预手段进行防治,因而PCG致病基因新突变及新型候选基因的研究尤为重要。前期研究中,课题组通过全外显子测序法在PCG家系中检测出一个新的候选基因P-A基因及其两个突变(c.580G>A,p.E194K;c.124-125>ins CAGCGGCGG,p.E42delinsAAAE),后经Sanger测序验证。因此本课题立足于前期研究结果,探讨P-A基因突变对小梁网细胞的影响及其在原发性先天性青光眼发病中可能的作用与机制。研究方法:(1)以人源小梁网细胞为实验对象,采用体外转染法分别将P-A基因两个突变型的真核细胞表达载体质粒(pCMV6-P-A-c.580G>A;pCMV6-P-A-c.124-125>ins CAGCGGGGG)转染进小梁网细胞,在光学显微镜下观察小梁网细胞的生长。(2)利用RT-PCR和Western Blot法检测P-A基因在mRNA水平和蛋白质水平的表达。(3)通过免疫细胞化学法检测P-A基因在小梁网细胞中的表达共定位。(4)利用RT-PCR法在mRNA水平检测内质网伴侣分子GRP79、PDI以及基质金属蛋白酶MMP-2的表达。(5)Hoechest33342荧光染色法和AnnexinV-APC流式细胞检测小梁网细胞凋亡/坏死情况。(6)通过CCK8吸光度比色法反映小梁网细胞贴壁情况。(7)使用划痕实验观察小梁网细胞的迁移情况。结果:(1)突变转染后的小梁网细胞呈现狭长的菱形,细胞核较未转染组变大变突出,胞质皱缩,细胞间彼此分离,密度较对照组明显降低。(2)在mRNA和蛋白水平上,p.E194K突变组表达量下降约30%左右;p.E42delinsAAAE突变组下降约15%。(3)通过免疫细胞化学法观察到Ac45蛋白在内质网中出现异常堆积。(4)在mRNA水平上,两个突变转染组中的内质网分子伴侣GRP78、PDI的表达增加,E194突变组增加较p.E42delinsAAAE组多;基质金属蛋白酶MMP-2表达显著降低。(5)p.E194K突变多引起晚期凋亡,p.E42delinsAAAE突变造成细胞早期凋亡。(6)p.E194K突变对小梁网细胞的粘附抑制率达40.72%,p.E42delinsAAAE突变组的粘附抑制率达均46.20%。(7)p.E194K突变令小梁网细胞迁移能力下降约50%,p.E42delinsAAAE突变令小梁网细胞基本丧失迁移能力。结论:P-A基因在维持小梁网细胞生长形态及功能中起重要作用。研究P-A基因突变对小梁网细胞的影响有助于阐明原发性先天性青光眼的致病机制。