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在很多颞下颌关节紊乱（temporomandibular joint disorder TMD）病患者的颞下颌领关节（temporomandibular joint TMJ）滑液中,都观察到了透明质酸的浓度和分子量下降,透明质酸是滑液的重要成分之一,含量和分子量的下降会引起滑液的润滑系数上升,关节运动时,摩擦系数变大,影响颞下颌关节的运动。患者会产生开闭口疼痛,咬合疼痛,影响咀嚼和发音,为了减轻患者的症状,改善患者的生存质量,临床上采用关节腔内注射外源性Hyaluronic Acid（HA）的方式,来补充滑液中HA的量,增加滑液的润滑,并通过与HA受体CD44和RHAMM等结合减少炎性细胞的数量,调整细胞因子的表达,抑制炎症反应,对关节组织起保护作用。1987年HA注射液（ARTZ）首先在日本获准用于人体骨关节炎的临床治疗,现在,HA关节腔内注射治疗骨关节病已经取得了肯定的疗效。这种治疗方法的缺点是外源性HA注射入关节腔内后会很快被吸收并排出关节腔,因此患者必须反复注射,增添了患者的痛苦。临床上很需要一种治疗方法,能使患者自己的颞下颌关节腔能自主合成分泌大分子量HA,从而避免反复关节腔注射带来的痛苦。已经知道关节滑液中的HA由滑膜（Synovial membrane SM）中的成纤维样滑膜细胞（Fibroblast-like synoviocytes FLSs）合成分泌,由透明质酸合成酶（Hyaluronic acid synthase HAS）合成,HAS 有三种,HAS 1,HAS2,HAS3。HAS2催化合成大的相对分子质量（molecular weight MW）较大的HA（HMW HA）。本研究希望能分离培养人的颞下颌关节滑膜细胞,并通过高表达透明质酸合成酶2（HAS2）的慢病毒载体转染滑膜细胞,得到能更高效催化合成高分子HA的细胞,为临床治疗TMD提供新的可能。本实验具体分为以下几个部分:实验一、克隆人HAS2基因目的得到人HAS2基因的完整片段。方法分离培养人正常TMJ的FLSs,提取全基因组后,设计合适的引物,利用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction PCR）扩增复制得到人HAS2基因,产物纯化后用琼脂糖电泳,酶切,基因测序等方法检测。结果电泳显示片段大小约为1.7kb,与目的片段大小相符,酶切显示与T载体连接正确,基因测序显示无碱基错误,与基因库比对后无误。结论得到了正确的人HAS2基因的TA克隆。实验二、构建EGFP-HAS2融合蛋白原核表达质粒,检测该基因的原核表达情况目的给HAS2加上荧光标记EGFP,便于后期实验是追踪观察,构建EGFP-HAS2融合蛋白原核表达质粒,希望HAS2能在原核生物大肠杆菌中表达,从而找到快速扩增HAS2的方法。方法从质粒FUGW中PCR扩增得到EGFP基因,并利用合适的酶切位点,通过限制性内切酶（Restriction endonuclease RE）和DNA连接酶,将EGFP基因连接到HAS2基因的上游,中间加入连接肽GGGGS,再将EGFP-GGGGS-HAS2基因片段插入原核表达质粒PET-28a,得到的重组质粒经酶切和基因测序证实连接正确后,转化到大肠杆菌BL21中,诱导表达后,提取总蛋白,做十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（dium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis SDS-PAGE）,考马斯亮蓝染色,蛋白质免疫印迹实验（Western Blot WB）检测EGFP-HAS2融合蛋白的表达。结果基因测序证实得到正确的EGFP基因和GGGGS连接肽,双酶切连接产物后琼脂糖电泳显示连接成功,重组原核表达质粒EGFP-GGGGS-HAS2-PET-28a构建成功,转化到原核表达载体一大肠杆菌BL21后,SDS-PAGE,考马斯亮蓝染色,Western Blot均未检测到目的条带。结论EGFP-HAS2融合蛋白在大肠杆菌中表达困难。实验三、含2A序列的绿色荧光蛋白标记的人透明质酸合成酶2基因真核表达载体的构建目的构建EGFP-HAS2融合蛋白的真核表达载体,并将连接肽改成有自剪切功能的T2A序列。方法利用PCR技术,修改EGFP-HAS2的连接肽,改为T2A序列,序列改为HAS2-2A-EGFP,再通过限制性内切酶和DNA连接酶,将目的片段插入真核表达载体FUGW,双酶切验证连接是否成功,再将重组质粒和包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒,感染人TMJ滑膜细胞观察是否有荧光。结果重组质粒酶切电泳显示连接成功,包装慢病毒后感染到人TMJ滑膜细胞后荧光显微镜照相显示有荧光,荧光强度随病毒浓度增大而增强。结论含2A序列的绿色荧光蛋白标记的人透明质酸合成酶2基因真核表达载体的构建成功,感染人TMJ滑膜细胞有表达。实验四、HAS2蛋白表达的检测目的进一步验证HAS2基因通过慢病毒介导,是否能在人TMJ滑膜细胞中表达。方法将带有HAS2的慢病毒感染人TMJ滑膜细胞后,培养三天后,通过Western Blot,细胞免疫荧光照相,观察HAS2的表达情况。结果Western Blot结果显示HAS2和EGFP都分别有表达,表达强度度随病毒滴度增加而增强,细胞免疫荧光照相显示感染慢病毒的细胞不仅有绿色荧光,同时还有红色荧光,证明细胞爬片很难区分蛋白质是定位在胞浆还是胞膜。结论外源性HAS2可以通过慢病毒介导在人TMJ滑膜细胞中表达,荧光标签也能表达,Western Blot结果也证明了 2A的自剪切作用。