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目的:慢性粒细胞白血病(CML)是一种起源于异常造血干细胞克隆的骨髓增殖性疾病,具有特征性的Ph染色体(philadelphia chromosome) ,组成性激活BCR/ABL融合基因是CML的特征,与CML的发病密切相关。近来,一些学者注意到BCR/ABL融合基因的表达状况和CML细胞的成熟度呈负相关,CML从慢性期发展到急变期,往往伴随着BCR/ABL mRNA水平的明显升高。研究表明,多种人类恶性肿瘤的发生发展及其演变与抑癌基因的点突变、重排或基因缺失所致的功能失活相关,在肿瘤细胞转化过程中,抑癌基因的功能失活比原癌基因的激活起着更重要的作用。和其它恶性肿瘤一样,白血病也包括多种癌基因和抑癌基因的异常,肿瘤抑制基因启动子区域CpG岛的高甲基化引起的基因表达沉默是人类白血病中普遍存在的现象【1】,研究抑癌基因的结构和表达异常对了解白血病的发生发展、细胞分化特征及制定基因治疗策略具有重要的临床意义。在肿瘤的发病机制研究中,酪氨酸磷酸化是真核生物各种生理活动的一个重要调控机制,它涉及细胞间及细胞内通信,参与决定细胞的形状和能动性,调控基因的转录水平,并且在胚胎发育、内环境稳定和免疫功能中起重要作用。酪氨酸磷酸化水平的异常在许多遗传性及获得性疾病的发病机制中扮演着关键的角色。蛋白酪氨酸磷酸酶(PTPs)和蛋白酪氨酸激酶(PTKs)共同调节着细胞内蛋白磷酸化水平,PTPs去磷酸化作用与PTKs磷酸化作用保持动态平衡,共同调节细胞生长、分化、信号传导、细胞周期调控等。一但打破这一平衡(或PTKs信号上调或PTPs活动下降),可促进细胞内酪氨酸磷酸化相关蛋白聚集,导致细胞异常增殖分化,从而导致各种恶性疾病。而肿瘤的发生与细胞内蛋白磷酸化水平改变有很大关联。近来的研究表明,蛋白酪氨酸磷酸酶在决定细胞酪氨酸磷酸化水平中起着更显著的作用【2】。研究蛋白酪氨酸磷酸酶在恶性血液病发病机制中的作用成为近年来的研究热点。PTPRO(Gleppl,PTP-U2)是新发现的PTPs家族成员,是JAK/STAT信号转导途径负调控因子之一。PTPRO位于染色体12p12.3【3】,在多种肿瘤细胞如肝癌、肺癌等存在特定位点的杂合子缺失(LOH)是其重要特征之一,其截短型(PTPROt)仅限于造血细胞表达。有人研究发现PTPROt可以去磷酸化并抑制BCR/ABL融合基因的激活,在CML细胞株K562中异位表达可以导致BCR/ABL融合基因的去磷酸化并使其下游靶点CrkL和Stat5磷酸化,证实PTPROt对BCR/ABL融合基因起负性调控作用。而且PTPROt在K562细胞中表达可以抑制细胞增殖,延迟细胞周期从G0/G1期到S期,阻断其恶性增殖。PTPROt抑制K562细胞株增殖,促进其凋亡,并有可能使BCR/ABL融合基因转阴。通过对鼠源骨髓细胞株研究发现PTPROt失活后失去对BCR/ABL的抑制作用后使得BCR/ABL在骨髓细胞过量表达。一种甲基转移酶抑制剂5-杂氮胞苷使K562细胞中PTPROt启动子CpG岛去甲基化而重新表达。这些数据表明,PTPROt启动子甲基化可能导致了底物的磷酸化使PTPROt活性抑制,并为BCR/ABL融合基因阳性表达的白血病提供重要的分子治疗靶点。【4】本研究以此为基础,旨在检测CML患者中PTPROt的表达情况,并应用5-杂氮胞苷(5-Azacytidine)对K562细胞进行干预,观察PTPROt的表达变化、细胞增殖与凋亡变化,而研究PTPROt在CML发病机制中的作用及临床意义。方法:本研究对象为82例CML患者,其中慢性期64例,加速急变期18例,CML细胞株K562细胞。20例健康志愿者作为正常对照。其中慢性期组又分为初治组(BCR/ABL融合基因阳性)和治疗后缓解组(BCR/ABL融合基因阴性)。将K562细胞分为5-杂氮胞苷干预组和非干预组。采用实时荧光定量PCR方法对CML患者骨髓、20例正常对照外周血及5-杂氮胞苷处理前和处理后K562细胞进行PTPROt mRNA水平的检测。应用MTT法检测K562细胞增殖抑制率。应用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:1 CML患者慢性期组、加速急变期组PTPROt表达水平与正常对照组比较明显降低,P<0.05,有统计学意义;PTPROt在正常人中表达率为95%(19/20),基因相对表达水平为0-0.927,中位数为0.435。在慢性期组患者64例中,PTPROt的阳性率为79.69%(51/64),表达水平为0-0.299,中位数为0.159;加速急变期组患者PTPROt的表达阳性率为61.11%(11/18),表达水平为0-0.166,中位数为0.047.加速急变期组PTPROt的表达水平与慢性期组比较明显降低,P<0.05,有统计学意义。2 CML初治组患者和治疗后缓解组患者PTPROt mRNA表达水平与正常对照组比较明显降低,P<0.05,有统计学意义;初治组患者PTPROt的阳性率为79.69%(51/64),表达水平为0-0.299,中位数为0.159;治疗后缓解组患者PTPROt的阳性率为98.30% (26/27),表达水平为0-0.494,中位数为0.272;治疗后缓解组患者PTPROt mRNA表达水平与初治组患者比较明显升高,P<0.05,有统计学意义。3 K562细胞中PTPROt mRNA无表达,经5-杂氮胞苷作用后PTPROt mRNA重新表达;随着时间和药物作用浓度的增加,PTPROt mRNA表达水平升高,P<0.05,有统计学意义。4 5-杂氮胞苷抑制K562细胞的增殖,在一定范围内与药物浓度及作用时间呈正相关。5 5-杂氮胞苷可使K562细胞凋亡率增加,且作用也呈时间和药物浓度依赖性。结论:1 CML患者较正常对照组PTPROt mRNA表达水平下降,加速急变期PTPROt mRNA表达水平明显低于慢性期PTPROt mRNA表达水平,治疗后缓解组患者PTPROt mRNA表达水平较初治组患者PTPROt mRNA表达水平明显升高,监测PTPROt mRNA表达水平变化可作为判断CML预后的参考指标。2 K562细胞中PTPROt mRNA无表达,经5-杂氮胞苷作用后PTPROt mRNA重新表达;因此K562细胞中PTPROt基因无表达可能是PTPROt基因启动子甲基化所致。5-杂氮胞苷可以通过去甲基化使K562细胞中PTPROt mRNA重新表达,在一定范围内呈时间和药物浓度依赖性,且抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡。