目的研究钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ(Calmodulin-dependent kinase Ⅱ,CaMKⅡ)γRNA干扰对破骨细胞生成、骨吸收功能以及下游信号分子活化T-细胞核因子c1(Nuclear factor of activated T-cells cytoplasmic 1,NFATc1)、非受体酪氨酸激酶(cell-sarcoma receptor coactivator,c-Src)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)基因表达的影响,以证实CaMKⅡγ在破骨细胞分化中的关键调控作用和分子机制。方法1破骨细胞分化中CaMKⅡγ基因表达规律研究。应用50 ng/ml受体活化核因子-κB配体(Receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)诱导小鼠RAW264.7细胞向破骨细胞分化,并于诱导第0d、1d、3d、5d四个时间点收获细胞,采用实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光细胞化学法检测破骨细胞分化中CaMKⅡγ基因的表达规律。2唑唻膦酸对破骨细胞分化及相关基因表达影响的研究。小鼠RAW264.7细胞分为两组:A组为对照组,B组为唑来膦酸处理组。两组细胞均用50 ng/ml RANKL诱导细胞向破骨细胞分化;B组在培养1d后,加用1×10-6mol/L的唑来膦酸处理2d,然后撤掉唑来膦酸,继续培养。于第5d、7d收获细胞进行相关检测。应用TRAP染色、牙本质磨片吸收陷窝检测评价两组细胞破骨细胞生成及骨吸收情况;并通过实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光细胞化学检测两组细胞CaMKⅡγ、NFATc1、TRAP、c-Src基因表达情况。3唑来磷酸对破骨细胞分化中CaMKⅡ和Colmodulin蛋白结合的影响。小鼠RAW264.7细胞分为A、B两组:A组为对照组,B组为唑来磷酸处理组。两组均用50ng/ml RANKL诱导,B组在1 d后加用1×10-6 M唑来膦酸处理2 d。应用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)及反向Co-IP对CaMKⅡ与Colmodulin蛋白结合进行分析。4 CaMKⅡγRNA干扰对破骨细胞分化及相关基因表达的影响。应用携带绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体构建三个CaMKⅡγ重组RNA干扰载体。阴性载体转染RAW264.7细胞,确定最适的病毒转染滴度MOI值和转染效率。在最佳MOI值下用CaMKⅡγ重组RNA干扰载体转染RAW264.7细胞,通过实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法检测破骨细胞向分化中三个CaMKⅡγ重组载体的干扰效果,确定干扰效果最佳的重组干扰载体,用于下一步实验。实验分为A、B、C三组:A组为对照组、B组为阴性载体组、C组为干扰载体组。细胞转染12小时后,换用含50 ng/ml RANKL的培养基诱导细胞向破骨细胞分化,并于诱导5天后收获细胞。通过TRAP染色及牙本质磨片吸收陷窝检测评价三组细胞破骨细胞生成及骨吸收情况;通过实时荧光定量PCR、蛋白质印迹法、免疫荧光细胞化学检测三组细胞CaMKⅡγ及其下游相关基因NFATc1、TRAP、c-Src基因表达情况。结果1破骨细胞分化第0d、1d、3d、5d,CaMKⅡγmRNA水平分别为1.067±0.179、1.840±0.070、9.493±0.453和30.767±0.573;蛋白水平分别是494.567±20.121、663.533±38.741、858.600±19.367和980.367±23.403;与第0d比较,除第1d蛋白水平外(P>0.05),各时间点m RNA水平(P<0.01)及蛋白水平(P<0.01)均呈时间依赖性表达增强。免疫荧光检测显示第0d和1d蛋白表达较弱,而在第3d和第5d蛋白表达强度明显增加,并有多核破骨细胞形成。2唑唻膦酸处理下B组多核破骨细胞数、牙本质吸陷窝数目和面积分别为11.33±1.52(个)、8.66±2.08(个)和5034.35±775.42μm2,较对照组的37.66±5.68(个)、23.00±4.00(个)和15042.71±1906.03μm2显著减少(P<0.01),下降幅度分别为69.91%、62.60%和66.53%。唑来膦酸对破骨细胞分化过程中CaMKⅡγ及其下游因子NFATc1、TRAP和c-Src m RNA及蛋白水平也产生了抑制作用;与A组比较,B组上述4个基因m RNA水平分别下降了44.603%、54.126%、58.942%和51.546%(P<0.01);蛋白水平分别下降了46.127%、36.799%、27.140%和32.060%(P<0.01);免疫荧光细胞化学也证实B组蛋白水平明显下降。3 Co-IP及反向Co-IP检测显示,B组CaMKⅡ与Calmodulin蛋白结合较A组显著降低,分别下降了59.75%和50.87%(P<0.01);在总蛋白中,B组Calmodulin与CaMKⅡ蛋白较A组也显著下降,分别降低了52.12%和51.49%(P<0.01)。4本实验成功构建了CaMKⅡγ重组慢病毒干扰载体。最适病毒滴度MOI值是30,其转染效率>80%。经实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测,#3重组载体对CaMKⅡγ干扰效果最佳,干扰效率在m RNA及蛋白水平分别为78.158%和62.226%;因而应用#3重组干扰载体进行下面实验。经转染后,三组细胞中C组(干扰载体组)多核破骨细胞数、牙本质吸陷窝数目和面积在分别为10.670±1.52(个)、87.330±1.528(个)和4922.000±64.086μm2,显著低于B组(阴性载体组)的22.670±1.2528(个)、12.670±2.082(个)、0924.330±66.905μm2和A组(对照组)的26.670±1.528(个)、16.000±1.000(个)、11980.000±70.000μm2(P<0.05);而A组和B组之间无显著性差异(P>0.05)。CaMKⅡγRNA干扰显著抑制了CaMKⅡγ及其下游因子NFATc1、TRAP、c-Src的表达。实时荧光定量PCR检测表明C组CaMKⅡγ、NFATc1、TRAP、c-Src m RNA水平较A组分别下降了79.872%、49.856%、43.649%和53.567%(P<0.01);蛋白质印迹法检测显示C组上述4个基因蛋白水平较A、B组也显著减弱(P<0.01),下降幅度与B组比较分别为61.70%、54.22%、46.75%和45.86%;免疫荧光化学检测也证实C组上述基因荧光强度明显弱于A、B组。结论1.CaMKⅡγ在破骨细胞分化中呈时间依赖性表达增强,提示其在破骨细胞分化中可能发挥关键调控作用;2.唑来膦酸可显著抑制破骨细胞生成、骨吸收及CaMKⅡγ、NFATc1、cSrc、TRAP基因表达;上述基因可能参与了唑唻膦酸对破骨细胞的抑制;3.唑来膦酸可显著抑制破骨细胞分化中CaMKⅡ与Calmodulin的蛋白结合,这可能与其诱发的破骨细胞抑制有关;4.CaMKⅡγRNA干扰可显著抑制破骨细胞生成、骨吸收功能及下游基因NFATc1、c-Src、TRAP的表达;上述基因可能介导了CaMKⅡγ对破骨细胞分化的调控。