背景大肠癌是人类最常见的消化系统恶性肿瘤之一,包括结肠癌和直肠癌。从全球来看,大肠癌的发病率和死亡率在持续升高。每年全世界有超过100万的大肠癌患者被确诊,且在全世界恶性肿瘤的发病率和死亡率中,其发病率占第三位,死亡率占第四位。在西方发达国家,尽管其检测技术,手术和化疗技术较先进,大肠癌在恶性肿瘤的死亡率中占第二位。我国大肠癌的发病率虽低于西方国家,近年来随着生活水平的提高和饮食结构的改变,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势。2006年国家卫生部的统计数据显示,我国大肠癌死亡率已位居恶性肿瘤第五位,其发病率在40岁开始上升,至60-75岁时达高峰。预防结肠癌已经成为一个很大的、时有争议的、公共健康问题。腺瘤是散发性大肠癌最主要的癌前病变。据估计约50%以上的人会有大肠腺瘤,但仅有6%的腺瘤可发展为大肠癌。虽然大多数腺瘤并未发展为大肠癌,我们仍需要对其进行筛查,特别是很有可能发展为大肠癌的腺瘤,也称为进展期腺瘤。进展期腺瘤是指腺瘤大小≥1cm或低分化腺瘤或有绒毛成分的腺瘤,是大肠癌的高危因素,需严密筛查。因此,有必要对普通人群进行筛查和对高危人群进行监视。众所周知,恶性肿瘤的发生发展是一个多基因作用的多阶段过程。大量研究表明,有一套特定基因的改变导致并推动了大肠癌的发生发展。染色体不稳定性、微卫星不稳定性、表观遗传学改变等为大肠癌的主要发生机制。由基因转录沉默所引起的表观遗传学改变是大肠癌的发生机制之一,表观遗传(epigenetics)学是指不涉及基因组DNA序列改变而在细胞分裂过程中可以遗传给子代细胞的基因组修饰作用,目前最为人们所知的表观遗传学主要方式是DNA甲基化。由于DNA甲基化往往发生在大肠癌发生过程中的早期,很容易在患者的粪便中检测到。因此,检测粪便中DNA甲基化状态有望成为大肠癌筛查和早期无创诊断的一条新途径。Vimentin是中间丝纤维蛋白家族的一员,在很多方面表现出复杂的基因表达模式。主要表达于胚胎组织和由间叶组织来源的成体细胞。越来越多的研究已经表明,Vimentin的表达并非是间充质起源细胞及向间叶分化的肿瘤细胞的特异性生物标志。已经发现角蛋白和Vimentin在乳腺癌、肝细胞肝癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胃癌、食管癌、结肠癌、肺癌等上皮源性恶性肿瘤中的共同表达,而且与癌细胞的侵袭性强和易转移密切相关。另有研究证实,与肿瘤、癌前病变(如腺瘤)产生相关的Vimentin的表达下调可能与其启动子的甲基化密切相关。这提示DNA甲基化可以从基因转录水平下调Vimentin的表达,其对于肿瘤细胞迁移具有促进作用。Chen等研究显示未发生转移的早期大肠癌组织和晚期大肠癌的Vimentin基因的甲基化率是相等的,还有研究表明Vimentin基因甲基化与肿瘤大小和Duke’s分期无关,这些都说明Vimentin基因甲基化检测对大肠癌早期诊断的重要性。目的本文应用甲基化特异性PCR(MSP)技术分析了60例大肠癌患者、17例大肠腺瘤患者及30例正常对照者粪便中Vimentin基因甲基化状态,并对同一份粪便标本用免疫化学法进行粪便隐血试验检测,以比较和评估Vimentin基因甲基化作为大肠癌早期诊断中的可行性和临床意义。资料和方法粪便标本取自2009年5月至2010年8月郑州大学第一附属医院收治的大肠癌、腺瘤患者和门诊行结肠镜检查的病人,所有标本均经内镜病理证实。60例大肠癌患者中,男37例,女23例,男女比例为1.6：1,年龄范围为23-82岁,平均年龄63.4岁；17例大肠腺瘤的患者中,男12例,女5例,男女比例为2.4：1,年龄范围为28-76岁,平均年龄58.2岁。另选择30例年龄匹配的健康人为正常对照组,全结肠镜检查结果均为全结肠粘膜未发现异常。正常对照组中男15例,女15例,男女比例为1：1,年龄范围为32-79岁,平均年龄为59.4岁。有炎症性肠病、其他癌症病史和主要心里疾病的患者均未被纳入本研究中。粪便标本于术前或内镜检查前收集,收集后立即送至试验室,分装后置-70℃冰箱保存。所有患者住院或门诊检查时均用免疫化学法检测粪便潜血。对粪便标本进行预处理,后用QIAamp DNA Stool Minikit(Qiagen,德国)试剂盒提取DNA,提取出的DNA保存在200ul的AE缓冲液中,并放置于-20℃的冰箱中。然后再按照EpiTect Bisulfite Kit(Qiagen,德国)试剂盒操作说明书进行DNA的亚硫酸氢盐修饰和纯化,放置于-70℃冰箱保存备用。重亚硫酸氢盐修饰后的DNA作为MSP的模板检测Vimentin基因甲基化状态。实验结果应用SPSS 17.0统计软件处理,基因频率采用直接计数法,各组间率的比较采用χ2检验和Fisher确切概率法检验。检验结果以P<0.05为差异有统计学意义。结果1在60例大肠癌患者的粪便标本中,有31例(51.67%)检测出Vimentin基因甲基化,有13例(21.67%)粪便隐血检测阳性。Vimentin基因甲基化检测诊断大肠癌的敏感性(51.67%)与粪便隐血试验的敏感性(21.67%)相比较,χ2=11.6268,P=0.000<0.05。2在17例大肠腺瘤患者的粪便标本中,有4例(23.53%)检测出Vimentin基因甲基化,1例(5.88%)粪便隐血检测阳性。Vimentin基因甲基化检测诊断大肠腺瘤的敏感性(23.53%)与粪便隐血试验的敏感性(5.88%)相比较,P=0.3353>0.05。3 Vimentin基因甲基化状态改变与大肠癌患者的性别、年龄、肿块大小没有明显的相关性(P>0.05)。4 Vimentin基因甲基化状态改变与大肠腺瘤患者的腺瘤大小、发生部位无明显相关性(P>0.05)。5 Vimentin基因甲基化状态改变在左半结肠癌和右半结肠癌的发生率分别为60.98%和31.58%,差异有统计学意义(χ2=4.493,P=0.034)；在Dukes分期A、B和C、D期中发生率分别为82.14%和25%,差异有统计学意义(χ2=19.5265,P=0.000)。6 Vimentin基因甲基化检测对大肠癌和大肠腺瘤的特异性均为100%,粪便隐血试验的特异性为96.7%。结论1甲基化特异性PCR检测粪便中Vimentin基因甲基化状态改变是大肠癌筛查和早期诊断的简便、可行的方法。2 Vimentin基因甲基化状态改变与大肠癌患者的性别、年龄、肿块大小、肿瘤组织分化无明显相关性。3 Vimentin基因甲基化状态改变与大肠癌患者的肿瘤Dukes分期和肿瘤发生部位呈明显相关。4 Vimentin基因甲基化状态改变与大肠腺瘤患者的腺瘤大小和发生部位无明显相关性。5 Vimentin基因甲基化检测对大肠癌和大肠腺瘤的特异性和敏感性均高于粪便隐血试验。