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目的：
人类白细胞抗原-G（human leukocyte antigen-G，HLA-G）属于非经典HLA I类分子，包括膜结合型（mHLA-G）和可溶型（sHLA-G）分子。HLA-G分子通过与特异性受体结合，发挥免疫抑制作用。HLA-G分子表达具有组织特异性，正常情况下仅表达于母胎界面上，但在一些病理条件下，如肿瘤细胞及病毒感染细胞等可诱导表达HLA-G分子。研究发现HLA-G可在多种肿瘤组织中表达，且其表达水平与肿瘤细胞的分化程度、TNM疾病分期、患者预后等高度相关，提示HLA-G在肿瘤发生发展中具有重要作用。以往研究主要通过体外实验，采用动物荷瘤模型等体内研究尚属起步。
以往裸鼠荷瘤动物模型研究表明，HLA-G表达参与肿瘤免疫逃避，促进肿瘤生长，导致裸鼠死亡时间缩短。为进一步研究HLA-G表达对荷瘤小鼠免疫排斥的影响，本研究以人小细胞肺癌细胞株NCI-H446与NCI-H446-G为研究对象，通过建立肺癌异种荷瘤C57BL/6小鼠模型，分析NCI-H446细胞HLA-G分子表达前后，对免疫健全的C57BL/6小鼠肿瘤成瘤及免疫排斥时间（记录肿块消失时间）、荷瘤小鼠脾脏髓系衍生抑制性细胞（MDSCs）和M1/M2型巨噬细胞比值的影响，探讨HLA-G分子在异种荷瘤小鼠体内对肿瘤生长及免疫排斥的作用及机制。
方法：
1.HLA-G对肺癌细胞NCI-H446体外增殖的影响：培养转染HLA-G的人肺癌细胞NCI-H446（下文均用NCI-H446-G表示）和未转染HLA-G的NCI-H446细胞；CFSE染色法检测NCI-H446与NCI-H446-G细胞在0h、12h、24h、48h荧光强度变化，分析HLA-G分子表达对NCI-H446细胞增殖能力的影响。
2.HLA-G对体外巨噬细胞分化及细胞因子分泌的影响：采用PMA诱导THP-1细胞分化，建立体外诱导巨噬细胞模型，加入可溶性HLA-G分子处理48h，流式细胞术分析巨噬细胞表型及细胞培养上清液中细胞因子水平变化。
3.肺癌异种荷瘤C57BL/6小鼠模型建立：通过体外培养NCI-H446和NCI-H446-G细胞，细胞生长对数期收取细胞。随后将NCI-H446和NCI-H446-G细胞以及空白对照PBS分别注射到每组小鼠右侧腹股沟皮下，观察小鼠的成瘤情况；按计划于接种后d5、d10、d15及d20天解剖小鼠，获取小鼠肿瘤瘤体与脾脏；记录肿瘤体积和重量，绘制肿瘤生长曲线；肿瘤组织进行免疫组织化学染色检测HLA-G分子表达。
4.荷瘤C57BL/6小鼠脾脏MDSCs以及M1/M2比例分析：在接种后d5、d10、d15、d20收取NCI-H446和NCI-H446-G及PBS组小鼠脾脏，制备脾细胞悬液。通过CD11b及Gr-1荧光抗体标记，流式细胞术检测不同组别在各个时间点MDSCs的细胞比例；通过F4/80以及CD80荧光抗体标记M1巨噬细胞，F4/80以及CD206荧光抗体标记M2巨噬细胞，流式细胞术检测不同组别在各个时间点M1/M2巨噬细胞比值。
结果：
1.HLA-G对肺癌细胞NCI-H446体外增殖的影响：CFSE增殖分析发现，NCI-H446及NCI-H446-G组在0h、12h、24h、48h时间点的荧光强度分别为（261573vs261685），（86278±2880vs61380±3383；P＜0.001），（55806±3151vs35634±1175；P＜0.001），（14213±948vs8911±838；P＜0.001）。每个时间点NCI-H446-G组的荧光强度小于对照组，表明NCI-H446-G细胞组荧光强度在48h内衰减速度快于对照组，其NCI-H446-G细胞的增殖能力高于NCI-H446细胞，提示HLA-G表达能够促进NCI-H446细胞的增殖。
2.HLA-G对体外巨噬细胞分化及细胞因子分泌的影响：PMA诱导THP-1细胞分化为M0巨噬细胞，经HLA-G处理，培养48h后，流式检测结果显示，HLA-G处理前后，CD68+CD80+CD86+（M1）的比例为（10.58±1.36%vs10.04±3.36%；P＞0.05），CD68+CD163+CD206+（M2）的比例为（5.49±3.04%vs6.58±2.08%；P＞0.05），提示HLA-G分子在体外对M1/M2无明显的诱导分化作用。细胞因子检测结果显示，HLA-G处理前后IL-6浓度分别为（94.57±15.91pg/ml vs147.00±15.52pg/ml；P＜0.05），TNF-α浓度分别为（610.72±83.47pg/ml vs3206.62±484.46pg/ml；P＜0.05），表明HLA-G可促进IL-6及TNF-α的分泌。
3.肺癌异种荷瘤C57BL/6小鼠模型建立：结果显示，C57BL/6小鼠在接种NCI-H446和NCI-H446-G细胞后，体内肿瘤在接种后前五天生长最快，但随着时间的增加，肿瘤体积逐渐缩小。NCI-H446及NCI-H446-G组接种后d5、d10、d15、d20的肿瘤体积（mm3）分别为（98.50±41.12vs217.25±47.81；P＜0.05），（51.50±9.73vs116.17±25.23；P＜0.05），（22.31±9.28vs46.21±5.53；P＜0.05）及（0vs17.17±13.38；P＞0.05）。此外，NCI-H446细胞组与NCI-H446-G细胞组的肿瘤质量（mg）分别为（48.17±13.11vs85.53±8.66；P＜0.05），（34.30±12.31vs59.37±12.15；P＞0.05），（7.20±0.96vs25.33±3.06；P＜0.05）及（0vs13.90±8.81；P＞0.05）。接种后的第20天，NCI-H446-G组的肿瘤依然肉眼可见，而NCI-H446细胞组肿瘤已经完全排斥。免疫组织化学染色结果显示NCI-H446-G组肿瘤标本HLA-G表达阳性，对照组HLA-G表达阴性。
4.荷瘤C57BL/6小鼠脾脏MDSCs及M1/M2比例分析：接种后d5、d10、d15、d20天收取各组小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，流式细胞术分析。结果发现在NCI-H446和NCI-H446-G组中MDSCs均存在先升高随后开始减低的趋势。其中第5天时，NCI-H446组与NCI-H446-G组的脾脏MDSCs比例分别为（16.70±0.70%vs20.40±1.90%；P＜0.05），表明NCI-H446-G组小鼠脾脏中MDSCs比例升高，两者的差异具有统计学意义；同时第5天时，NCI-H446组和NCI-H446-G组小鼠脾脏中的M1/M2比值分别为（0.52±0.03%vs0.42±0.05%；P＜0.05），表明NCI-H446-G组小鼠脾脏中M1/M2比值降低，两者的差异具有统计学意义。
结论：
本研究以肺癌细胞株NCI-H446和NCI-H446-G为研究对象，体外细胞实验和肺癌异种荷瘤C57BL/6小鼠模型实验，探讨HLA-G分子在异种荷瘤小鼠体内对肿瘤生长及免疫排斥的作用及机制。体外细胞实验结果显示，HLA-G分子表达后，能够促进NCI-H446细胞的增殖及巨噬细胞IL-6和TNF-α细胞因子的分泌。C57BL/6小鼠荷瘤模型实验结果显示，HLA-G可通过MDSCs增殖及M1/M2巨噬细胞平衡，促进异种肺癌荷瘤小鼠体内肿瘤生长及延迟肿瘤免疫排斥的发生。
人类白细胞抗原-G（human leukocyte antigen-G，HLA-G）属于非经典HLA I类分子，包括膜结合型（mHLA-G）和可溶型（sHLA-G）分子。HLA-G分子通过与特异性受体结合，发挥免疫抑制作用。HLA-G分子表达具有组织特异性，正常情况下仅表达于母胎界面上，但在一些病理条件下，如肿瘤细胞及病毒感染细胞等可诱导表达HLA-G分子。研究发现HLA-G可在多种肿瘤组织中表达，且其表达水平与肿瘤细胞的分化程度、TNM疾病分期、患者预后等高度相关，提示HLA-G在肿瘤发生发展中具有重要作用。以往研究主要通过体外实验，采用动物荷瘤模型等体内研究尚属起步。
以往裸鼠荷瘤动物模型研究表明，HLA-G表达参与肿瘤免疫逃避，促进肿瘤生长，导致裸鼠死亡时间缩短。为进一步研究HLA-G表达对荷瘤小鼠免疫排斥的影响，本研究以人小细胞肺癌细胞株NCI-H446与NCI-H446-G为研究对象，通过建立肺癌异种荷瘤C57BL/6小鼠模型，分析NCI-H446细胞HLA-G分子表达前后，对免疫健全的C57BL/6小鼠肿瘤成瘤及免疫排斥时间（记录肿块消失时间）、荷瘤小鼠脾脏髓系衍生抑制性细胞（MDSCs）和M1/M2型巨噬细胞比值的影响，探讨HLA-G分子在异种荷瘤小鼠体内对肿瘤生长及免疫排斥的作用及机制。
方法：
1.HLA-G对肺癌细胞NCI-H446体外增殖的影响：培养转染HLA-G的人肺癌细胞NCI-H446（下文均用NCI-H446-G表示）和未转染HLA-G的NCI-H446细胞；CFSE染色法检测NCI-H446与NCI-H446-G细胞在0h、12h、24h、48h荧光强度变化，分析HLA-G分子表达对NCI-H446细胞增殖能力的影响。
2.HLA-G对体外巨噬细胞分化及细胞因子分泌的影响：采用PMA诱导THP-1细胞分化，建立体外诱导巨噬细胞模型，加入可溶性HLA-G分子处理48h，流式细胞术分析巨噬细胞表型及细胞培养上清液中细胞因子水平变化。
3.肺癌异种荷瘤C57BL/6小鼠模型建立：通过体外培养NCI-H446和NCI-H446-G细胞，细胞生长对数期收取细胞。随后将NCI-H446和NCI-H446-G细胞以及空白对照PBS分别注射到每组小鼠右侧腹股沟皮下，观察小鼠的成瘤情况；按计划于接种后d5、d10、d15及d20天解剖小鼠，获取小鼠肿瘤瘤体与脾脏；记录肿瘤体积和重量，绘制肿瘤生长曲线；肿瘤组织进行免疫组织化学染色检测HLA-G分子表达。
4.荷瘤C57BL/6小鼠脾脏MDSCs以及M1/M2比例分析：在接种后d5、d10、d15、d20收取NCI-H446和NCI-H446-G及PBS组小鼠脾脏，制备脾细胞悬液。通过CD11b及Gr-1荧光抗体标记，流式细胞术检测不同组别在各个时间点MDSCs的细胞比例；通过F4/80以及CD80荧光抗体标记M1巨噬细胞，F4/80以及CD206荧光抗体标记M2巨噬细胞，流式细胞术检测不同组别在各个时间点M1/M2巨噬细胞比值。
结果：
1.HLA-G对肺癌细胞NCI-H446体外增殖的影响：CFSE增殖分析发现，NCI-H446及NCI-H446-G组在0h、12h、24h、48h时间点的荧光强度分别为（261573vs261685），（86278±2880vs61380±3383；P＜0.001），（55806±3151vs35634±1175；P＜0.001），（14213±948vs8911±838；P＜0.001）。每个时间点NCI-H446-G组的荧光强度小于对照组，表明NCI-H446-G细胞组荧光强度在48h内衰减速度快于对照组，其NCI-H446-G细胞的增殖能力高于NCI-H446细胞，提示HLA-G表达能够促进NCI-H446细胞的增殖。
2.HLA-G对体外巨噬细胞分化及细胞因子分泌的影响：PMA诱导THP-1细胞分化为M0巨噬细胞，经HLA-G处理，培养48h后，流式检测结果显示，HLA-G处理前后，CD68+CD80+CD86+（M1）的比例为（10.58±1.36%vs10.04±3.36%；P＞0.05），CD68+CD163+CD206+（M2）的比例为（5.49±3.04%vs6.58±2.08%；P＞0.05），提示HLA-G分子在体外对M1/M2无明显的诱导分化作用。细胞因子检测结果显示，HLA-G处理前后IL-6浓度分别为（94.57±15.91pg/ml vs147.00±15.52pg/ml；P＜0.05），TNF-α浓度分别为（610.72±83.47pg/ml vs3206.62±484.46pg/ml；P＜0.05），表明HLA-G可促进IL-6及TNF-α的分泌。
3.肺癌异种荷瘤C57BL/6小鼠模型建立：结果显示，C57BL/6小鼠在接种NCI-H446和NCI-H446-G细胞后，体内肿瘤在接种后前五天生长最快，但随着时间的增加，肿瘤体积逐渐缩小。NCI-H446及NCI-H446-G组接种后d5、d10、d15、d20的肿瘤体积（mm3）分别为（98.50±41.12vs217.25±47.81；P＜0.05），（51.50±9.73vs116.17±25.23；P＜0.05），（22.31±9.28vs46.21±5.53；P＜0.05）及（0vs17.17±13.38；P＞0.05）。此外，NCI-H446细胞组与NCI-H446-G细胞组的肿瘤质量（mg）分别为（48.17±13.11vs85.53±8.66；P＜0.05），（34.30±12.31vs59.37±12.15；P＞0.05），（7.20±0.96vs25.33±3.06；P＜0.05）及（0vs13.90±8.81；P＞0.05）。接种后的第20天，NCI-H446-G组的肿瘤依然肉眼可见，而NCI-H446细胞组肿瘤已经完全排斥。免疫组织化学染色结果显示NCI-H446-G组肿瘤标本HLA-G表达阳性，对照组HLA-G表达阴性。
4.荷瘤C57BL/6小鼠脾脏MDSCs及M1/M2比例分析：接种后d5、d10、d15、d20天收取各组小鼠脾脏，制备脾细胞悬液，流式细胞术分析。结果发现在NCI-H446和NCI-H446-G组中MDSCs均存在先升高随后开始减低的趋势。其中第5天时，NCI-H446组与NCI-H446-G组的脾脏MDSCs比例分别为（16.70±0.70%vs20.40±1.90%；P＜0.05），表明NCI-H446-G组小鼠脾脏中MDSCs比例升高，两者的差异具有统计学意义；同时第5天时，NCI-H446组和NCI-H446-G组小鼠脾脏中的M1/M2比值分别为（0.52±0.03%vs0.42±0.05%；P＜0.05），表明NCI-H446-G组小鼠脾脏中M1/M2比值降低，两者的差异具有统计学意义。
结论：
本研究以肺癌细胞株NCI-H446和NCI-H446-G为研究对象，体外细胞实验和肺癌异种荷瘤C57BL/6小鼠模型实验，探讨HLA-G分子在异种荷瘤小鼠体内对肿瘤生长及免疫排斥的作用及机制。体外细胞实验结果显示，HLA-G分子表达后，能够促进NCI-H446细胞的增殖及巨噬细胞IL-6和TNF-α细胞因子的分泌。C57BL/6小鼠荷瘤模型实验结果显示，HLA-G可通过MDSCs增殖及M1/M2巨噬细胞平衡，促进异种肺癌荷瘤小鼠体内肿瘤生长及延迟肿瘤免疫排斥的发生。