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研究背景肥胖是一个巨大的公共健康问题,与2型糖尿病、动脉粥样硬化、高血压、癌症、哮喘、中风、非酒精性脂肪肝等代谢疾病密切相关。肥胖时出现脂肪组织的扩展,包括脂肪细胞体积增加和脂肪细胞数量增加。脂肪组织中的低度慢性炎症被认为参与上述代谢疾病的发生发展过程,现在有研究证据表明内质网应激在这种低度慢性炎症中起了关键作用。内质网是几乎所有分泌型和整合型膜蛋白的主要组装场所。许多生理和病理损伤如异常钙调节、病毒感染、环境毒素、氧化还原损伤、突变蛋白表达、酸中毒、辐射、衰老和分泌蛋白的合成增加等,这些异常破坏了蛋白质的平衡,导致内质网的蛋白质折叠能力受到损伤,未折叠蛋白积累增加,引起内质网应激。为了缓解内质网应激和协调内质网功能的恢复,细胞启动一种通过控制特定下游转录因子的活性将蛋白质折叠信息从内质网转移到细胞核的综合途径称为未折叠蛋白反应(UPR)。UPR有三个嵌入内质网膜的传感器:PERK,IRE1,ATF6,主要通过三种途径在恢复内质网平衡中发挥着关键作用:1)在一段时间内专注于翻译衰减,减少新合成的蛋白质进入内质网,导致整体蛋白质的合成减少;2)诱导内质网伴侣基因上调,使内质网中蛋白质正确折叠所需的分子伴侣表达增加;3)为适应高蛋白质负荷,内质网室发生增殖,启动与内质网相关的未折叠或错误折叠蛋白质的降解(ERAD)。人类肥胖受试者的皮下脂肪组织中α7烟碱受体(α7nAChR)的表达水平降低,α7nAChR的激活表现出显著的抗炎作用。α7nAChR是非神经元型胆碱能系统(non-neuronal cholinergic system,NNCS)的一员,在非神经元细胞上广泛表达,包括脂肪细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等。非神经元型胆碱能系统是一类存在于外周组织(包括肝脏和肌肉组织)和细胞(包括脂肪细胞、主动脉内皮细胞及巨噬细胞)上的胆碱能系统,由nAChR或mAChR、乙酰胆碱、胆碱酯酶等组成。α7nAChR激动剂尼古丁预处理大鼠脂肪细胞时,培养时间长的脂肪细胞中促炎细胞因子TNF-α随着尼古丁浓度的增加以剂量依赖性方式下降;用α7nAChR特异性激动剂PNU-282987在体外刺激人脂肪细胞会产生显著的抗炎作用,从而降低脂多糖诱导的IL-6、MCP-1和TNF-α等促炎基因的表达。由此可知α7nAChR介导的非神经元型胆碱能系统在调节脂肪细胞炎症方面发挥着重要的作用。脂肪组织内质网应激与低度慢性炎症密切相关,本研究旨在利用Western Blot、RT-PCR、免疫荧光等技术研究非神经元型胆碱能系统中α7nAChR的活化对脂肪细胞内质网应激的作用,以及具体作用机制,为治疗肥胖及肥胖相关疾病提供一个新的治疗靶点及理论基础。方法1.培养从中科院上海生科院细胞库购买的3T3-L1前脂肪细胞,经典激素鸡尾酒法诱导分化为脂肪细胞。用CCK8检测不同浓度的Tm分别处理12 h、18 h、24 h后的脂肪细胞活力,用RT-PCR、Western Blot检测不同浓度的Tm分别处理12h、18h、24h后脂肪细胞内质网应激标志的表达水平,选择合适的浓度及时间构建内质网应激模型。2.根据文献选择使用的α7nAChR非选择性激动剂ACh、NIC和选择性激动剂GTS-21以及α7nAChR选择性拮抗剂MLA的浓度为10 μmol/L。用CCK8检测10 μmol/L 的 ACh、NIC、GTS-21、MLA 处理 48 h 后的脂肪细胞活力,用 RT-PCR、Western Blot检测10μmol/L的ACh、NIC、GTS-21、MLA分别处理3h、6h、12 h、24 h、36 h、48 h后的脂肪细胞内质网应激标志的表达水平。3.3T3-L1 脂肪细胞设立 Control 组、Tm 组、MLA+Tm 组、ACh+Tm 组、NIC+Tm组、GTS-21+Tm 组、MLA+ACh+Tm 组、MLA+NIC+Tm 组、MLA+GTS-21+Tm组。细胞用或不用MLA先处理2h,再用ACh、NIC、GTS-21处理36h,最后用Tm处理12 h,Western Blot检测α7nAChR的活化对UPR信号通路的影响。4.3T3-L1 前脂肪细胞设立 Control 组、Tm组、MLA+Tm 组、ACh+Tm 组、NIC+Tm组、GTS-21+Tm 组、MLA+ACh+Tm 组、MLA+NIC+Tm 组、MLA+GTS-21+Tm组。细胞用或不用MLA先处理2h,再用ACh、NIC、GTS-21处理36h,最后用Tm处理12 h,Western Blot检测α7nAChR的活化对UPR信号通路的影响。5.3T3-L1前脂肪细胞设立Control组、Tm组、ACh+Tm组、NIC+Tm组、GTS-21+Tm组,先使用ACh、NIC、GTS-21预处理36 h,然后用Tm处理12 h,免疫荧光检测α7nAChR的活化对UPR信号通路的ATF6、p-eIF2α蛋白的影响。研究结果1.选择Tm浓度1 μg/ml处理12 h来构建脂肪细胞内质网应激模型。2.10μmol/L浓度的ACh、NIC、GTS-21、MLA处理脂肪细胞48 h不影响脂肪细胞活力,不诱导正常脂肪细胞产生内质网应激。3.α7nAChR的活化降低了 3T3-L1脂肪细胞中UPR信号通路的XBP1u、ATF6、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、p-IRE1α/IRE1α 等蛋白的表达水平,增加 CHOP、XBP1s的蛋白表达水平,但对分子伴侣Bip的蛋白表达水平没有影响,MLA的单独使用几乎没有效果,但是能阻断ACh、NIC、GTS-21的作用。4.α7nAChR的活化降低了 3T3-L1前脂肪细胞中UPR通路的Bip、CHOP、XBP1u、ATF6、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、p-IRE1α/IRE1α 等蛋白的表达水平,增加XBP1s的蛋白表达水平,MLA的单独使用几乎没有效果,但是能阻断ACh、NIC、GTS-21 的作用。5.α7nAChR的活化降低了 3T3-L1前脂肪细胞中UPR通路的ATF6蛋白的核转位,p-eIF2α蛋白的细胞质水平。结论1.非神经元型胆碱能系统的活化在生理状态下不会诱导产生内质网应激;2.α7nAChR的活化抑制了急性内质网应激时PERK-eIF2α和ATF6信号通路的表达强度;3.α7nAChR的活化抑制了急性内质网应激时p-IRE1α/IRE1α蛋白的表达,但是进一步上调了XBP1s蛋白的表达,为调节代谢应激强度、防治肥胖提供了新的调控靶点。