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目的:广泛筛选、鉴定产几丁质酶酵母,对其产生的胞外几丁质酶进行分离、纯化及性质研究,为进一步研究其在果蔬采后真菌病害防治中的应用提供科学依据。
方法:利用几丁质作唯一碳源的选择培养基,从土壤、水果果实表面以及实验室保存的菌种中筛选产几丁质酶酵母;通过透明圈法和DNS比色法,筛选出酶产量较高的菌株进行鉴定及酶纯化研究;观察该酵母菌株个体和群体培养特征,利用常规方法进行部分生理生化特征鉴定,并以26SrDNA序列为基础分析该菌株与其他模式菌株的相似性及同源关系,综合这几项特征对该酵母菌进行鉴定;利用硫酸铵盐析、DEAE-纤维素(DE32)柱层析、SephadexG-100柱层析对该酵母产生的胞外几丁质酶进行纯化,结果用SDS-PAGE验证;利用常规实验方法研究该酶的基本性质,并研究其在平板实验上对供试病原菌的拮抗活性。
结果:1.利用几丁质作唯一碳源的选择培养基,分离出9株产几丁质酶酵母菌(依次编号为CY-1~CY-9),发现CY-6菌株产酶能力最强,其发酵液酶活力达2.41U/mL。
2.通过观察CY-6菌株个体和群体培养特征,进行部分生理生化特征鉴定,发现该菌株的表型特征与陆生伊萨酵母(Issatchenkiaterricola)最为接近。以26SrDNA的D1/D2区域为基础,分析该酵母菌与其他模式菌株序列的相似性并构建系统发育树,发现该菌株与陆生伊萨酵母(I.terricola)相似性大于99%,且在系统发育树中聚成一亚分支。综合其形态培养特征、生理生化特征及26SrDNA序列分析结果,将该酵母鉴定为陆生伊萨酵母(I.terricola)。
3.以不同的诱导物诱导该酵母产酶,结果表明胶体几丁质的诱导效果最好。通过纯化得到一条分子量约为42.4kD的酶带,其反应的最适温度和最适pH分别为50℃和7.0,以胶体几丁质为底物的Km和Vmax分别为6.91mg/mL和12.95umol/min。
4.抗菌实验显示,用纯化后的酶液对供试病原菌进行平板拮抗实验,发现该酶对病原菌菌丝的延伸有不同程度的抑制作用。
结论:1.分离筛选出9株产几丁质酶酵母菌,其中CY-6菌株产酶能力最强,其发酵液酶活力达到2.41U/mL。
2.综合CY-6菌株形态培养特征和生理生化特征,结合26SrDNA序列分析结果,将该酵母鉴定为陆生伊萨酵母(I.terricola)。
3.纯化出该酵母菌产生的一种胞外几丁质酶,测得该酶的分子量为42.4kD,酶反应的最适温度和最适pH分别为50℃和7.0,以胶体几丁质为底物的Km和Vmax分别为6.91mg/mL和12.95umol/min,且该酶对几种供试病原菌有不同程度的抑制作用。