阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)又称老年痴呆症,是老年期痴呆症最常见的类型。AD的主要病理特征为脑内细胞外的老年斑(senile plaques,SP)沉积、神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFT)及神经元缺失变性。而β-淀粉样蛋白(Aβ)是大脑皮质老年斑的主要成分,并且可能是AD致病的核心机制。虽然Aβ蛋白诱导神经元毒性的具体机制仍不完全清楚,但是线粒体功能障碍可能在Aβ蛋白引起神经元毒性的过程中发挥重要作用。线粒体损伤导致神经元功能障碍可能是包括AD在内的神经退行性疾病的共同特征。有充分的证据表明Aβ改变了Bcl-2家族的表达,进而调节线粒体凋亡通路。Bax/Bcl-2表达升高可以引起线粒体膜电位降低,细胞色素C释放,随后导致细胞凋亡。JNK信号转导通路可能是线粒体凋亡信号通路的上游通路之一。同时,体内外研究结果证实Aβ可引起神经元JNK信号激活,进而激活线粒体凋亡信号通路。所以,抑制其激活可能是缓解Aβ引起的神经元毒性的有效办法之一。神经甾体(neurosteroid)是中枢神经系统中各种甾体及其代谢产物的总称。孕酮(PROG)是一种重要的内源性神经甾体,除了在生殖系统发挥作用,还可影响神经系统功能。退行性疾病、创伤性脑损伤、中风、缺氧缺血性脑损伤、脊髓损伤等多种动物实验模型均证实孕酮具有神经保护作用。临床试验研究显示孕酮在治疗创伤性脑损伤方面有很好的应用效果。其发挥神经保护的机制主要包括提高神经元存活率,减轻脑水肿、抑制炎症反应和细胞凋亡。也有文献报道孕酮在神经系统发挥作用主要通过其代谢产物别孕烯醇酮(AP)实现。但是关于孕酮发挥神经保护作用的机制仍不完全清楚。与其他大部分甾体激素一样,孕酮也是通过结合特异性细胞受体发挥作用的。孕酮经典受体不仅存在于生殖系统,也在神经系统广泛的表达,发挥各种生理作用。除了孕酮经典受体,越来越多的证据表明孕酮可通过非经典受体机制发挥重要作用,其中研究最多的是孕酮膜结合蛋白1(PGRMC1),其可能在神经系统发挥神经保护作用。前人研究结果提示PGRMC1信号通路的调节可能是孕酮发挥神经保护作用的重要机制之一。第一部分孕酮对Aβ25-35所致神经元损伤的保护作用目的:观察孕酮对Aβ25-35所致原代培养大鼠皮质神经元损伤的保护作用,探索孕酮是否可能通过其代谢产物别孕烯醇酮(AP)发挥神经保护作用。方法:新生1d内SD乳鼠,取皮层部位进行体外培养,培养至神经元成熟以后,以βⅢ-Tubulin(TUJ1)神经元特异性抗体和Hoechst33258双染鉴定神经元纯度。采用Aβ活性片断Aβ25-35体外诱导损伤神经元建立AD细胞模型。通过MTT或Hoechest 33258核染色法测定加入不同浓度孕酮、别孕烯醇酮或非那雄胺作用后神经元存活率及凋亡率。结果:1原代大鼠大脑皮质神经元纯度鉴定双染结果显示神经元细胞纯度>90%。2孕酮对AD细胞模型神经元存活率的影响经MTT法检测,与溶剂对照组相比,25μM Aβ35-25作用于神经元48h后,细胞存活率没有明显变化;而25μM Aβ25-35作用48 h后,大鼠皮质神经元明显损伤,细胞的存活率为溶剂对照组的(59.9±6.0)%(P<0.01);与Aβ25-35组比较,PROG能浓度和时间依赖地抑制Aβ25-35诱导的神经毒性作用。应用MTT检测,1μM孕酮对Aβ25-35处理48 h后,显示出最大的保护作用,其存活率为溶剂对照组的(86.7±4.2)%(P<0.01)。3孕酮对AD细胞模型神经元凋亡率的影响显微镜下观察,对照组细胞核内多呈弥散均匀的淡蓝色荧光,有少量调亡细胞的细胞核呈分叶、碎片状,呈亮蓝色(11.7±2.0)%;单加孕酮组与溶剂对照组比较,没有明显差别(10.3±2.3)%;Aβ25-35模型组调亡细胞明显增多(49.6±7.3)%;1μM孕酮与Aβ25-35共孵育后神经元调亡细胞数量明显降低(26.8±2.2)%。4 5α-还原酶抑制剂非那雄胺对孕酮在AD细胞模型神经保护作用的影响非那雄胺(finasteride)是一种特异性Ⅱ型5α-还原酶抑制剂,可以有效阻断孕酮代谢为别孕烯醇酮。MTT结果显示,与Aβ+PROG组比较,非那雄胺预处理组(Aβ+PROG+finasteride)神经元的细胞存活率没有显著变化。提示非那雄胺不能阻断孕酮的神经保护作用。5别孕烯醇酮(AP)对Aβ25-35诱导的AD细胞模型神经元存活率的影响与对照组比较,Aβ25-35组神经元细胞的存活率为(57.9±4.8)%(P<0.01);与模型组比较,在0.001μM~1μM范围内,别孕烯醇酮(AP)共孵育组神经元细胞的存活率均无统计学差异(P>0.05);而AP(10μM)组细胞存活率与模型组相比显著降低(P<0.01)。提示在此模型下小剂量AP没有显示出神经保护作用,而大剂量AP具有细胞毒性。结论:1 PROG能浓度和时间依赖地抑制Aβ25-35诱导的神经毒性作用,提高细胞存活率,降低细胞凋亡率。2在细胞模型下,PROG对抗Aβ25-35引起的神经元损伤,不是通过其代谢物AP发挥作用的。第二部分孕酮通过抑制线粒体凋亡通路减轻Aβ所致神经元损伤目的:观察孕酮对Aβ25-35所致原代培养大鼠皮质神经元线粒体凋亡通路的保护作用,探讨PROG的神经保护作用机制。方法:以Aβ25-35体外诱导损伤神经元建立AD细胞模型。以荧光染色技术检测孕酮干预后,线粒体膜电位的变化。应用Western-blot技术,研究孕酮干预后,Bcl-2、Bax和cleaved-caspase 3表达的变化。结果:1 PROG对Aβ25-35诱导的AD模型神经元细胞线粒体膜电位的影响荧光倒置显微镜下观察,与溶剂对照组比较,Aβ25-35诱导的模型组神经元细胞线粒体荧光明显增加,经罗丹明荧光染色法检测,Aβ处理组的细胞的线粒体膜电位为溶剂对照组的(65.9±4.5)%(P<0.01)。与模型组比较,PROG保护组的神经元细胞线粒体膜电位呈明显增加趋势,为溶剂对照组的(81.9±4.7)%(P<0.01)。2 PROG对Aβ25-35诱导的AD模型神经元胞浆中Bax/Bcl-2比值的影响采用Western-blot检测,Aβ25-35诱导的模型组胞浆中Bax/Bcl-2比值约为对照组的8.1倍,显著高于对照组(P<0.01)。与模型组比较,PROG共孵育后Bax/Bcl-2表达比值呈显著降低趋势,约为模型组的53%(P<0.01),其中单加孕酮组(1μM)组胞浆Bax/Bcl-2表达比值与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。3 PROG对Aβ25-35诱导的AD模型神经元胞浆中cleaved-caspase 3水平的影响Western-blot检测显示,Aβ25-35诱导的模型组胞浆中cleaved-caspase 3表达水平为对照组的4.9倍,显著高于对照组(P<0.01)。与模型组比较,PROG共孵育后cleaved-caspase 3表达水平呈显著下降趋势,约为模型组对照组的47%(P<0.01);其中单加孕酮组(1μM)胞浆cleaved-caspase 3表达水平与对照组比较无统计学差异(P>0.05)。结论:PROG对抗Aβ25-35诱导的神经元损伤时,PROG能抑制线粒体凋亡途径主要相关蛋白改变,升高线粒体膜电位,降低cleaved-caspase 3表达。表明PROG能通过线粒体凋亡途径抑制Aβ25-35诱导产生的神经损伤作用。第三部分孕酮通过PGRMC1减轻Aβ所致神经元损伤目的:探索孕酮是否通过classic PR或PGRMC1对Aβ蛋白引起的皮层神经元损伤产生保护作用,方法:Western blot法检测Aβ对神经元PGRMC1和classic PR表达的影响;在Aβ25-35体外诱导损伤神经元建立AD细胞模型下,通过MTT、Hoechest 33258核染色法测定classic PR抑制剂(RU486)和PGRMC1抑制剂(AG205)对孕酮的抗凋亡作用的影响;应用Western-blot技术,研究PGRMC1的阻断剂(AG205)对孕酮的线粒体通路保护作用的影响。结果:1免疫细胞化学结果显示原代培养大鼠皮质神经元表达PGRMC1和classic PR结果显示,PGRMC1在神经元的胞体和突起都有丰富的表达,有少量PGRMC1在胞核表达。Classic PR主要在胞核表达,有少量存在于胞浆中。2 Western blot法检测结果显示Aβ对皮质神经元PGRMC1和classic PR表达的影响Western blot法检测结果显示,Aβ25-35处理48 h后,皮质神经元内PGRMC1的表达明显增加。与对照组(Ctrl)相比,Aβ25-35组PGRMC1的相对表达少量增加(P<0.01)。而Aβ25-35处理组Classic PR与对照组无显著差异。3 RU486和AG205对孕酮对抗Aβ引起的神经元毒性作用的影响MTT结果显示,与孕酮保护组(25μM Aβ25-35+1μM PROG)比较,不同浓度RU486预处理组(25μM Aβ25-35+1μM PROG+RU486)神经元存活率无显著差异。提示RU486不能阻断孕酮的神经保护作用。而5μM AG205预处理组(25μM Aβ25-35+1μM PROG+5μM AG205)与孕酮保护组(25μM Aβ25-35+1μM PROG)比较,细胞存活率显著降低(P<0.01)。提示AG205能部分阻断孕酮的神经保护作用,孕酮是通过PGRMC1发挥神经保护作用。Hoechst33258核染色法进一步证实5μM AG205可以部分阻断孕酮的神经保护作用。4孕酮部分通过PGRMC1调控线粒体凋亡通路。罗丹明染色结果显示,与Aβ损伤组比较,孕酮保护组线粒体膜电位显著升高,而AG205预处理组与孕酮保护组比较,线粒体膜电位显著下降。使用Western blot法检测显示,预加入AG205后,Bax/Bcl-2比例上升,cleaved-caspase 3增多,抑制了孕酮的作用。这些结果表明孕酮通过PGRMC1调控线粒体凋亡通路。从而发挥神经保护作用。结论:1 Aβ上调皮质神经元中PGRMC1的表达,但不影响classic PR的表达。2孕酮部分通过PGRMC1抑制线粒体凋亡通路,进而对抗Aβ引起的神经元毒性。第四部分孕酮通过抑制JNK磷酸化减轻Aβ所致神经元损伤目的:研究JNK信号通路在孕酮保护原代培养皮层神经元免受Aβ损伤的机制中的作用。方法:采用Western-blot检测孕酮或p-JNK抑制剂(SP600125)对Aβ25-35诱导的神经元JNK磷酸化的影响;采用MTT和Hoechst33258核染色法检测孕酮或p-JNK抑制剂(SP600125)对Aβ25-35诱导的神经元存活率和凋亡率的影响;采用Western-blot法观察PGRMC1的阻断剂(AG205)干预孕酮对Aβ25-35诱导的神经元p-JNK表达水平的影响。结果:1 PROG可以部分发挥p-JNK抑制剂的作用,降低Aβ25-35诱导的AD模型神经元胞浆中JNK磷酸化表达水平采用Western-blot检测,与对照组比较,模型组胞浆中p-JNK/JNK表达水平显著高于对照组(P<0.01);与模型组比较,100 nmol·L-1 SP600125预处理明显抑制了Aβ25-35诱导的p-JNK表达上升;PROG可以部分发挥p-JNK抑制剂的作用,明显抑制Aβ引起的p-JNK表达水平(P<0.01)。2 PROG在功能上可以部分模拟p-JNK抑制剂SP600125对抗Aβ引起的神经元毒性作用文献报道,抑制JNK磷酸化可以缓解Aβ引起的神经元毒性作用。MTT和Hoechst33258核染色法结果显示,与模型组比较,100 nmol·L SP600125预处理明显抑制Aβ引起的神经元毒性作用。PROG在功能上可以部分模拟p-JNK抑制剂SP600125对抗Aβ引起的神经元毒性作用。所以,我们认为孕酮的神经保护作用至少部分是通过抑制JNK磷酸化发挥作用的。另外,MTT和Hoechst33258核染色法结果显示,SP600125和孕酮共孵育比单独SP600125有更好的神经保护作用。提示孕酮可能还通过其他机制发挥神经保护作用。3孕酮抑制JNK磷酸化不依赖于PGRMC1第三部分证实孕酮部分通过PGRMC1发挥神经保护作用,这部分我们想证实是否孕酮抑制JNK磷酸化也依赖于PGRMC1。Western-blot检测结果显示,AG205没有影响孕酮对JNK磷酸化的抑制作用。这个结果提示孕酮抑制Aβ诱导的JNK磷酸化独立于PGRMC1。结论:1 PROG可以通过抑制JNK磷酸化对抗Aβ引起的神经元毒性作用。2孕酮抑制JNK磷酸化不依赖于PGRMC1。综上所述,本实验以Aβ25-35处理原代皮层神经元建立AD细胞模型,使用MTT、Hoechst33258核染色法、免疫细胞化学、Western blot等方法,研究孕酮对于Aβ25-35神经毒性的保护作用及其可能机制。研究发现孕酮对于Aβ25-35神经毒性的保护作用具有浓度和时间依赖性,且在1μM孕酮处理48 h的时候,孕酮的保护作用最为显著,因此,本实验采用此浓度和时间来研究孕酮的保护作用机制。研究首先发现,在本试验中,孕酮发挥神经保护作用不是通过其代谢物AP实现的;进一步发现孕酮通过缓解Aβ引起的线粒体膜电位降低来保护线粒体功能,并且孕酮能缓解Aβ引起的Bax/Bcl-2和cleaved-caspase 3上调,提示孕酮通过抑制线粒体凋亡通路来缓解Aβ引起的细胞毒性;然后我们发现PGRMC1抑制剂AG205可以部分阻断孕酮的神经保护作用,而RU486没有此功能,提示孕酮部分通过PGRMC1缓解Aβ引起的细胞毒性;最后我们发现孕酮可以通过抑制Aβ引起JNK激活来保护神经元,但此过程不通过PGRMC1。总之这些结果提示孕酮是通过两条互补的通路来缓解Aβ毒性:(1)通过PGRMC1进而抑制线粒体凋亡通路;(2)通过抑制Aβ引起JNK磷酸化。这些结果揭示了孕酮发挥神经保护作用的新机制。