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研究背景动脉粥样硬化(AS)是如今威胁2型糖尿病患者生命的主要慢性并发症,并且缺乏有效的治疗手段,早期干预十分重要。巨噬泡沫细胞形成是AS早期病理改变,因此寻找减少泡沫细胞形成的分子靶点成为防治AS的重要内容。研究表明,自噬介导的胆固醇逆向转运能有效缓解巨噬泡沫细胞形成,减少动脉斑块面积,对AS起到保护性作用。第三代组蛋白去乙酰化酶SIRT6被报道可通过抑制IGF-AKT通路来增强自噬参与调控多项病理过程,但在巨噬细胞中的作用以及相关机制目前尚无报道。我们前期研究表明在SIRT6在ox-LDL处理组明显下调,而过表达SIRT6可增加自噬效应分子的表达同时减少巨噬泡沫细胞的形成。目的本研究通过观察SIRT6对自噬通路的调控作用以及对巨噬泡沫细胞形成的影响,深入探讨其对动脉粥样硬化的保护性作用及潜在机制,通过寻找可能的作用靶点,为临床上糖尿病慢性并发症AS的诊治提供新思路。方法一、100 nM PMA处理THP1细胞72小时将其诱导贴壁形成巨噬细胞;50μg/ml ox-LDL处理已分化的THP1细胞24小时诱导形成巨噬泡沫细胞;二、运用慢病毒介导的基因调控技术分别构建过表达人SIRT6(LV-SIRT6)、HDAC酶活性缺失的SIRT6(LV-H133Y)以及SIRT6沉默(LV-shSIRT6)的THP1稳转细胞株,以空载病毒细胞(LV-Vector,LV-shScram)作为阴性对照,观察SIRT6对自噬通路的调控作用及巨噬泡沫细胞形成的影响;三、用油红O染色观察过表达SIRT6对巨噬泡沫细胞形成的作用;荧光分光光度计检测细胞质内总胆固醇(TC)、胆固醇酯(CE)含量并计算胆固醇酯水解率,以及胆固醇流出率。四、Western blot检测各组细胞间自噬通量、溶酶体生成相关蛋白LAMP1以及胆固醇流出介导蛋白ABCG1表达的差异;qRT-PCR检测各组细胞间自噬、溶酶体生成相关基因以及胆固醇流出相关基因的差异;Lysotracker Red染色观察各组间溶酶体生成情况;自噬双标腺病毒检测各组细胞间自噬流的情况;透射电镜检测各组细胞间自噬小体形成情况。五、运用小干扰RNA技术敲低ATG5阻断自噬;通过瞬时转染hsa-miR-33和anti-miR-33获得miR-33过表达和沉默的THP1细胞。结果一、在ox-LDL处理诱导巨噬泡沫细胞形成后,THP1细胞中SIRT6和自噬通量以及自噬效应分子的表达均下调,同时miR-33表达增加。二、过表达野生型SIRT6(LV-SIRT6)而不是HDAC酶活性缺失的SIRT6(LV-H133Y)可以显著减少ox-LDL诱导的巨噬泡沫细胞形成,而敲低SIRT6(LV-shSIRT6)之后巨噬泡沫细胞形成增加。三、过表达野生型SIRT6的THP1细胞在ox-LDL处理后显著诱导自噬相关分子表达、自噬小体和溶酶体形成以及自噬通量的增加;而敲低SIRT6的THP1细胞中上述指标均减弱。阻断自噬后,THP1细胞自噬相关效应分子表达减弱,同时ox-LDL诱导的巨噬泡沫细胞形成增加。四、过表达野生型SIRT6的THP1细胞在ox-LDL处理后胆固醇流出增加,同时miR-33表达减少而其靶蛋白ABCA1、ABCG1表达增加;在THP1细胞中转染has-miR-33可以抑制自噬标志物表达而转染anti-miR-33诱导自噬标志物表达。五、在过表达野生型SIRT6的THP1细胞中转染has-miR-33削弱了SIRT6诱导自噬并且减少巨噬泡沫细胞形成的作用。研究结论一、在促泡沫细胞形成的条件下,巨噬细胞中SIRT6表达和自噬水平受抑制。二、在受ox-LDL应激的巨噬细胞中,SIRT6依赖其HDAC活性通过诱导自噬水平以及溶酶体生成来减少泡沫细胞的形成,在正常状态下的巨噬细胞中SIRT6诱导自噬的效应不明显。三、在受ox-LDL应激的巨噬细胞中SIRT6依赖其HDAC活性促进胆固醇流出,减少细胞质内脂质堆积。四、在受ox-LDL应激的巨噬细胞中,SIRT6至少部分通过抑制miR-33的水平促进自噬相关效应分子的表达来促进细胞自噬,使细胞内胆固醇酯水解增加,胆固醇流出细胞外,减少脂质堆积。