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实验目的: 比较黄芪皂苷中有效成分抑制小胶质细胞激活活性,通过体内外系列实验明确其作用,并对其分子机制进行深入探讨,为传统中药黄芪的现代化应用提供一定的理论依据。 实验方法: (1)选用LPS刺激的BV-2细胞作为小胶质细胞激活模型,通过WB和Griess方法比较黄芪皂苷中成分抑制炎性介质释放的作用;运用糖皮质激素受体(GR)报告基因的方法对有效成分进行检测,观察其糖皮质激素样的作用。 (2)运用Griess和ELISA的方法对不同浓度的黄芪总皂苷(ASTT)进行活性检测,确定其药效最佳时的浓度。运用WB和Q-PCR等方法对其药效进一步确认,并通过ICC,核蛋白提取等方法对其分子机制进行深入研究。体内试验中选用侧脑室注射LPS作为小胶质细胞激活模型,腹腔注射ASTT,通过WB,ELISA和IHC等方法研究ASTT的药效及作用机制。 (3)运用Griess和ELISA的方法对黄芪皂苷Ⅰ(ASTⅠ)进行量效相关性检测,确定其最佳浓度,进而应用WB和Q-PCR方法从蛋白及mRNA表达水平确定其药效。分子机制方面,运用WB及ICC方法检测其对NFκB及IκB磷酸化激活的作用,并通过WB方法研究其上游PI3K/Akt等信号通路激活情况。 (4)运用上述类似方法对异黄芪皂苷Ⅰ(ISOⅠ)的活性进行检测并确定其最佳药物浓度。运用报告基因和ICC等方法,研究ISOⅠ抑制NFκB的磷酸化作用;运用WB方法研究其对PI3K/Akt以及MAPK等信号通路激活的影响。 (5)选用EAE小鼠模型,分别采用IHC(免疫荧光组织化学),Q-PCR以及WB方法综合判断黄芪甲苷(ASI)对小胶质细胞激活的抑制作用,运用RU486、TR-FRET及RNA干扰实验进一步确定ASI的作用靶点。 实验结果: (1) ASTI(100μM),ISOI(100μM),ASI(100μM)和ASTT(80μg/μl)均能有效抑制LPS诱导的小胶质细胞NO释放及iNOS的生成。 (2)黄芪皂苷对GR的激活作用不同,其中ASI能够促进GR荧光素酶报告基因的大量表达,而其他分子的激活作用较弱。 (3)在LPS诱导的小胶质细胞激活模型中,ASTT能够浓度依赖性的抑制NO及TNF-α的生成,其中ASTT(80μg/μl)效果最佳。ASTT(80μg/μl)无细胞毒性,能够显著降低iNOS,IL-1β,CD11b,TNF-α等促炎因子mRNA的表达,抑制iNOS蛋白的生成。在脑室注射LPS的小鼠模型中,ASTT同样能够抑制小胶质细胞的激活,减少炎性介质的生成。ASTT的作用机制与抑制PI3K/Akt/NFκB及MAPK等信号通路激活有关。 (4)在LPS诱导小胶质细胞激活模型中,ASTⅠ(100μM)能够减少NO及TNF-α的生成,抑制iNOS蛋白的表达,显著降低iNOS,IL-1β,CD11b及TNF-α等促炎因子mRNA的生成,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt等信号通路激活有关。 (5)在LPS诱导小胶质细胞激活模型中,ISOⅠ(100μM)能够抑制NO及TNF-α的大量生成,减少iNOS及Cox-2蛋白的表达,显著降低iNOS,IL-1β,CD11b及TNF-α等mRNA的表达,其作用可能与抑制PI3K/Akt/NFκB等信号通路激活有关。 (6) ASI能够通过糖皮质激素受体GR来抑制小胶质细胞的激活,其作用可以被GR siRNA或RU486所抑制;在EAE模型中,其作用效果能够被RU486所阻断;同时,GR配体竞争性实验显示ASI能够与GR蛋白结合。 结论: ASTⅠ,ISOⅠ,ASI及ASTT具有抑制LPS诱导的小胶质细胞激活的作用;其中,ASTⅠ可能通过影响PI3K/Akt等信号通路,ISOⅠ和ASTT可能通过影响PI3K/Akt以及MAPK等信号通路,而ASI可能通过激活GR相关信号通路,发挥糖皮质激素样作用,抑制炎症条件下小胶质细胞的激活。