背景 膀胱癌是最常见的泌尿系恶性肿瘤，近年来发病率明显上升。目前术前诊断和术后随访主要依据B超和膀胱镜检查，辅以尿脱落细胞学等检查。许多病人往往因为膀胱镜检查有痛苦而延误了病情，B超和尿脱落细胞学检查对早期肿瘤的发现和肿瘤复发效果也欠佳，尽管目前有许多膀胱肿瘤的标记物，但敏感性和特异性均不满意，因此我们研究血管内皮生长因子（VEGF）与膀胱肿瘤的关系，希望能找到一种更有效的膀胱肿瘤标记物。此外，尽管膀胱癌的治疗有手术、膀胱内药物灌注等方法，但膀胱癌患者肿瘤复发率及死亡率仍较高，特别是晚期膀胱肿瘤患者缺乏有效的治疗方法。大量研究表明血管生成是实体肿瘤生长、进展和转移的必要条件，肿瘤血管生成需要血管生成因子的作用，而血管内皮生长因子是最重要和作用最强的血管生成因子，研究显示VEGF的表达在膀胱肿瘤中广泛存在。因此，利用VEGF反义基因治疗膀胱肿瘤，可以减少VEGF表达，从而抑制肿瘤血管生成，使膀胱肿瘤生长受抑制和肿瘤坏死，从而达到治疗膀胱肿瘤的目的。所以，基因治疗膀胱肿瘤是一种新的探索，具有重要深远的意义。 本课题用ELISA定量分析的方法测定对照者和膀胱肿瘤患者手术前后血清和尿液中的VEGF水平，探讨患者血清、尿液中VEGF作为膀胱肿瘤标记物的可能性及其临床意义；构建人反义VEGF121 cDNA真核表达质粒，并将重组质粒转染人膀胱癌细胞株，研究反义基因治疗对膀胱癌细胞体外增殖和致瘤性的影响，探讨反义VEGF121 cDNA基因治疗膀胱肿瘤的作用和可行性，为膀胱癌的基因治疗提供一定的实验依据。第一部分 膀胱癌患者血清、尿液中VEGF的定量研究 目的研究VEGF在膀胱肿瘤患者的血清和尿液中表达情况，及其作为膀胱肿瘤标记物的价值。材料与方法 膀胱癌患者40例，表浅性膀胱肿瘤20例，浸润性膀胱肿瘤20例。对照组36例，包括膀胱良性疾病17例和健康普查者19例。其中15例患者在行膀胱肿瘤切除术后3个月后再次随访。5例在术后3～6个月复发后再次随访。 所有对象均在治疗开始前采集外周静脉血和收集中段尿，血清、尿液均以双抗体夹心ELISA方法测定VEGF含量，按试剂盒说明进行操作。尿液中VEGF值以<WP=5>该样本中尿肌酐浓度进行校正。 结果 以系列标准溶液的浓度为横坐标，以对应的光密度值为纵坐标制作标准曲线，对照标准曲线得到相应的VEGF浓度。所有膀胱癌患者和对照者血清、尿液中均检测到VEGF。膀胱癌患者血清和尿液VEGF平均水平分别为348.53±225.80 pg/mL和576.54±390.50 ng/gCr，都显著高于对照组（血清、尿液VEGF分别为123.89±50.19 pg/mL和60.08±36.26 ng/gCr）。膀胱癌病人随着分期升高而血清、尿液VEGF均呈相应升高的趋势。浸润性膀胱肿瘤中血清和尿液中VEGF水平明显比表浅性膀胱肿瘤要高。肿瘤切除术后3个月，绝大多数膀胱癌患者血清和尿液VEGF明显下降，而肿瘤复发者则又出现明显升高。 结论 本研究用ELISA定量分析的方法证明VEGF在膀胱肿瘤患者的血清和尿液中表达明显升高，并与肿瘤分期和分级密切相关，术后膀胱肿瘤患者血清和尿中VEGF水平降低，而复发者VEGF水平又重新升高，表明它们可以作为膀胱癌的肿瘤标记物，可望作为预后评估、疗效评价和术后随访监测的指标。 关键词血管内皮生长因子，膀胱肿瘤，血清，尿液，酶联免疫吸附试验第二部分 人反义VEGF121 cDNA表达质粒的构建 目的 构建pcDNA3-As-VEGF121重组质粒，为进一步研究VEGF反义基因对膀胱肿瘤的治疗作用奠定基础。材料与方法根据pcDNA3真核表达载体多克隆位点区特点和VEGF121 N端和C端氨基酸序列设计上游引物和下游引物。上游引物：5’-GCC GAA TTC ATG AAC TTT CTG CTG TCT T-3’ ；下游引物：5’-GTT GGA TCC TTA TCA CCG CCT CGG CTT-3’。上游引物引入EcoRⅠ位点，下游引物引入BamHⅠ位点，以pcDNA3-VEGF121为模板，PCR扩增VEGF121 cDNA，扩增产物经Klenow酶补平，BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，回收目的片段（0.48kb）。pcDNA3经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后，回收载体片段（5.4kb）。两片段连接后转化大肠杆菌DH5α，扩增转化菌并制备重组质粒，重组质粒经限制性内切酶酶切及DNA序列分析鉴定。结果pcDNA3-As-VEGF121重组质粒经3套限制性内切酶鉴定。BamHⅠ和EcoRⅠ限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3-As-VEGF121 后，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，出现0.48kb<WP=6>和5.4kb两个条带，0.48kb为VEGF121 cDNA片段，5.4kb为载体pcDNA3片段。BamHⅠ和EcoRⅤ限制性内切酶酶切重组质粒pcDNA3-As-VEGF121 后，出现0.49kb和5.39kb两个条带。BglⅡ和EcoRⅤ限制性内切酶酶酶切重组质粒pcDNA3-As-VEGF121 后，出现1.37kb和4.51kb两个条带。进行DNA序列分析与预期结果相符，阅读框架（ORF）正确。结论将VEGF121 cDNA反向插入pcDNA3载体后得到重组质粒pcDNA3-As-VEGF121 ，限制性内切酶酶切鉴定及DNA序列分析，表明pcDNA3-As-VEGF121构建成功。关键词血管内皮生长因子，膀胱肿瘤，反义cDNA，构建第三部分 转染人反义VEGF121 cDNA对人膀胱癌细胞增殖的研究 目的