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国际癌症研究机构的最新资料表明,肝癌是全球最常见的五种恶性肿瘤之一,2008年全球肝癌患者74.9万,死于肝癌的患者69.5万,其中中国肝癌患者40.2万,死于肝癌的患者37.2万(http://globocan.iarc.fr/)。据中国卫生部《2012中国卫生统计年鉴》显示,2011年恶性肿瘤高居我国主要疾病死亡率的首位,而其中肝癌位居恶性肿瘤死亡率的第二位(http://www.moh.gov.cn)。肝癌死亡率高的原因之一是当前肝癌的确诊通常是在晚期,因而错过了最佳的治疗时期,而且临床诊断后患者平均生存时间不到12个月。甲胎蛋白(alpha-fetoprotein, AFP)是目前肝癌诊断的特异性指标,但AFP测定存在假阳性和假阴性的问题。约20%的晚期肝癌患者,直至病故前,AFP测定仍为阴性。在我国90%以上的肝癌为肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)蛋白质糖基化是最重要的翻译后修饰之一,糖蛋白糖链在许多生理和病理过程中都起着十分重要的作用。疾病相关的糖组学研究表明,在许多肿瘤包括肝癌的发生、发展过程中糖蛋白的糖链结构都会发生改变,进而导致糖蛋白及其所在细胞的功能失常并引发细胞的恶性转化。因而,分析肝癌发生发展相关的糖链结构变化并发现肝癌相关的特征性糖链标志物将有助于早期检测肝癌。目前研究表明细胞周期调节失控与肿瘤的发生、发展有着紧密的联系,并且肿瘤细胞糖基化修饰的改变能够影响细胞周期调控和细胞的增殖能力,促进肿瘤的发展。因此,本论文以研究人肝癌细胞系细胞周期进程中糖链结构的差异变化为切入点,通过以下三部分的研究,以期能筛选出人肝癌细胞系细胞周期进程中变化明显的特征性糖谱。第一部分：人肝癌细胞系HepG2和正常人肝细胞系L02细胞周期同步化方法的建立。本部分研究结合现有的细胞周期同步化方法,通过实验条件的摸索和优化,最终确定可同时适用于HepG2和L02的一整套简便、快速、同步率高的细胞周期同步化方法,即TdR一次阻断法用于G1期同步化,TdR双阻断法用于S期和G2期同步化,诺考达唑阻断法用于M期同步化。采用流式细胞术检测分析,结果显示：通过以上同步化方法可分别获得(86.64±1.33)%的G1期,(74.28±1.06)%的S期,(91.26±1.62)%的G2期和(81.93±1.37)%的M期的HepG2同步化细胞,以及(73.44±1.43)%的G1期,(75.37±1.42)%的S期(73.14±0.96)%的G2期和(72.06±1.24)%的M期的L02同步化细胞,并且与对照组细胞比较其均具有显著性差异(P<0.05),可满足后续实验对细胞周期不同时相中糖蛋白糖谱分析的要求。第二部分：凝集素芯片技术分析同步化HepG2和L02细胞周期不同时相糖蛋白糖链结构的变化。本部分研究利用本实验室已建立的凝集素芯片方法对同步化的HePG2和L02细胞G1、S、G2和M期总蛋白分别进行检测分析,通过中值归一化方法对凝集素芯片结果进行归一化处理。按照三大类即HepG2细胞周期进程中、L02细胞周期进程中和HepG2与L02细胞周期不同时相中的糖蛋白糖链结构进行比较分析,通过凝集素芯片上细胞周期不同时相荧光信号值差异变化的凝集素,可推断出两种细胞系在细胞周期不同时相各自的糖蛋白糖链结构的差异表达规律：(1)HePG2细胞周期中糖蛋白糖链结构的差异表达,如：多聚α-1,3和α-1,6连接甘露糖,末端N-乙酰半乳糖胺(GalNAc),多聚N-乙酰乳糖胺(LacNAc)和(GlcNAc)n, GalNAc和O-糖链GalNAca-Ser/Thr(Tn抗原),及平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)和二、三天线的复杂N-糖链结构在HePG2G1期低表达,而在S、G2和M期高表达；(2)LO2细胞周期中糖蛋白糖链结构的差异表达,如：O-糖链Galβ1-3GalNAca-Ser/Thr(T抗原)和GalNAca-Ser/Thr(Tn抗原),GlcNAc和半乳糖基化N-糖链,分支和末端甘露糖和末端GlcNAc,唾液酸化a2-3Gaβ1-4GlcNAc和Ga1β1-4GlcNAc结构在L02G1期低表达,而在S、G2和M期高表达。然后再通过分别比较HepG2和L02在细胞周期4个时相中的荧光信号值差异变化的凝集素推断出HepG2在细胞周期不同时相中有别于L02发生的七类特征性糖链结构变化规律：(1)GlcNAc和半乳糖基化N-糖链,分支和末端的甘露糖和末端GlcNAc,及末端α-1,3连接甘露糖结构在G1期高表达,而在S期低表达；(2)末端岩藻糖基化和唾液酸化路易斯抗原(Sia-Lex)结构在G1期高表达,而在G2期低表达；(3)多聚a-1,3和a-1,6连接甘露糖,及a-Gal和a-GalNAc结构仅在S期高表达；(4)多于二天线的(GlcNAc)n,多聚LacNAc和LacNAc,及多价唾液酸(mμltivalent Sia)和(GlcNAc)n结构在S期显著高表达,而在G1、G2和M期显著低表达；(5)末端GalNAc,多聚LacNAc和(GlcNAc)n,及β-Gal结构仅在G1期低表达；(6)多于二天线的(GlcNAc)n,多聚N-乙酰乳糖胺(LacNAc)和LacNAc,多价唾液酸和(GlcNAc)n,及平分型GlcNAc和二、三天线的复杂N-糖链结构在G1期低表达,而在S期高表达；(7)O-糖链Galβ1-3GalNAca-Ser/Thr(T抗原)和GaINAca-Ser/Thr(Tn抗原),及核心岩藻糖化Fucal-6GlcNAc结构仅在S期低表达。该结果提示：通过对细胞周期中这些糖链结构的差异分析,可在肝癌发生的更早的阶段来预知肝癌的发生并为肝癌的早期诊断提供一些潜在的糖链标志物。第三部分：凝集素组织化学方法验证凝集素芯片的分析结果。根据第二部分凝集素芯片分析得到的与L02比较在HePG2细胞周期不同时相荧光信号值差异变化的凝集素,从中选取7种有代表性的差异凝纂素GSL-Ⅱ、AAL、GNA、DSA、PHA-E+L、Jacalin和PSA以及1种在两种细胞四个时相荧光信号值没有变化的凝集素UEA-Ⅰ,通过凝集素组织化学方法分别比较分析这些凝集素在HepG2和L02细胞G1、S和G2期的结合差异。结果显示：每种凝集素在细胞周期不同时相与细胞特定区域的结合强度是有差别的,其结果与对应的凝集素芯片分析结果完全一致。同时,通过该结果可同时确定每种凝集素识别的糖链在不同时相两种细胞系中的定位,为进一步了解这些糖链分子的生物学功能提供了实验依据。综上所述,通过本课题的研究,构建出人肝癌细胞系细胞周期糖蛋白糖链特征性变化的糖谱。通过分析人肝癌细胞系细胞周期进程中糖链结构的变化,为在肝癌更早期寻找用于诊断的糖链标志物提供依据,并为肝癌的诊断和治疗提供新的潜在靶点。