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酶作为生物大分子活性物质,以其独特的催化性能,已被广泛应用于化工、食品、环境等领域。但其在工业应用领域常具有不稳定性的特点,尤其是在高温、有机溶剂中很容易失活,限制了其工业用途。来源于极端环境的微生物为了适应环境的需要常常表现出独特的稳定性,以这类酶作为模板研究其稳定机制有助于相关理论的探寻及为其他酶类改造提供指导。 来源于金属蛋白酶M4家族的嗜热蛋白酶(Thermolysin,TLNt)和蛋白酶PT121(Pseudolysin)具有较高的稳定性,其中Thermolysin表现出较高的温度耐受性,而Pseudolysin由本实验室筛选到的来源于铜绿假单胞杆菌PseudomonasaeruginosaPT121所产蛋白酶,意外的发现该酶与嗜热蛋白三维结构极度相似,酶学性质上除了温度稳定性的优势外还具有较高的溶剂稳定性。 本文克隆了嗜热蛋白酶Thermolysin基因npr,实现了在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)及枯草芽孢杆菌B.subtilisWB800中的均异源表达,其中枯草芽孢杆菌中实现胞外分泌表达,发酵液上清酶活达到1000U/mL。通过序列比对发现两个对热稳定性至关重要的氨基酸残基(37位和119位),实验表明TLNs(37N/119Q)的热稳定性明显高于TLNt(37D/119E),为了解析关键位点对热稳定性所起的作用,定点突变构建了另外两个单点突变体分别命名TLNs1(37D/119Q)和TLNs2(37N/119E),发现60℃下TLNs1的半衰期是TLNt(37D/119E)稳定性的3.6倍,而TLNs2稳定性相对于TLNt明显下降。 以嗜热蛋白酶TLNt及TLNs、TLNs1和TLNs2为研究对象,在不同温度梯度下(300K、350K和380K)进行20-ns纯水相体系的全原子分子动力学模拟。通过分析模拟过程中的均方根偏差RMSD、均方根扰动RMSF等参数的变化研究不同酶在不同温度下结构变化差异,结果表明TLNs1和TLNs2在高温下(350K和380K)的结构变化小,模拟结果与实验吻合。通过分析盐键,氢键占据率等相互作用力从分子水平解释了温度稳定性差异的机理。 以蛋白酶PT121为模板,进行了随机突变,建立了基因突变库并筛选到了11株典型突变体,对11株典型突变体进行同源建模分析,发现突变体的残基多数位于通道附近,对9N,13G以及20D的分析,表明由于突变位点由原来较大的侧链被替换为较小的侧链使得稳定性下降,而G13A正是由于侧链变大使得稳定性增强。 综上所述,获得了两个温度稳定性明显提升嗜热蛋白酶突变体TLNs1和TLNs,由于其较高的温度稳定性具有潜在的工业应用价值。对随机突变获得的蛋白酶PT121典型突变体分析,初步了解溶剂稳定性机理。本文借用分子模拟等手段结合试验解析了两个氨基酸对于热稳定性及通道附近残基对于溶剂稳定性的作用。为相关酶类的改造提供了有价值的理论依据。