随着人口预期寿命的延长和出生率的不断降低,人口老龄化已成为日渐突出的社会现象。随之带来一系列社会和医疗相关的挑战,突出方面就是心血管疾病发生率的不断升高。流行病学调查已证实老龄是心血管疾病的高危因素,研究显示老龄人口血管功能受损,表现为血管顺应性下降,自我修复能力降低,最终导致动脉粥样硬化等血管疾病。其中的重要机制,就是内皮细胞的老化。细胞的衰老是各种内外环境压力共同作用的结果。衰老细胞内基因表达异于相对年轻细胞,导致细胞功能受损、分裂停止。内皮细胞的老化原因多样,主要是细胞不断分裂及血液内过氧化物的损伤,最终促进动脉粥样硬化及血栓的形成。因此,延缓内皮细胞的衰老可能在减少心血管疾病方面有着重大的意义。血小板反应蛋白(thrombospondin-1,TSP1)是一种细胞基质糖蛋白,最早发现以未活化形式储存于血小板中,也可来源于内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞等多种细胞类型。TSP1有多重结构域,可与多种细胞表面受体结合,例如CD47、CD36、低密度脂蛋白受体相关蛋白1(LRP1)等。正常人体循环系统内TSP1浓度仅有20?g/L,但对调节血管功能和内环境稳态却有重要意义。近年来研究发现,TSP1与配体CD47结合后可起到抑制内皮细胞NO通路的作用,从而抑制血管舒张。此外,TSP1可通过拮抗血管内皮生长因子(VEGF)作用抑制血管新生,还可通过上调TGF-?水平从而促进糖尿病相关动脉粥样硬化斑块形成。有研究发现,TSP1在衰老组织中表达上升,并推测可能与衰老生物体组织血供减少这一现象相关。CD47又称为整合素相关蛋白(IAP),广泛表达于多种组织细胞表面。CD47与巨噬细胞上的SIRPα结合后可保护细胞免于被巨噬细胞吞噬,与TSP1结合则可有效抑制内皮细胞NO通路,介导血管收缩;还有研究显示CD47与TSP1的多肽4N1K结合后可介导多种细胞死亡(包括人的脑微血管内皮细胞),但具体机制不详;最近有研究称CD47缺失的小鼠肺内皮细胞具有干细胞特性,可分化为多种组织细胞,具体机制仍不明了。我们在前期研究中发现CD47缺失的鼠脑微血管内皮细胞具有更强的传代能力,结合之前的文献报道,我们考虑CD47-TSP1通路对内皮细胞的衰老可能有一定的调控作用,而相关研究报道至今不明确,因此CD47-TSP1对内皮细胞衰老调控及其机制具有很大的研究价值。首先,我们提取8周龄雌性CD47缺失及WT小鼠的脑微血管内皮细胞作为研究对象,进行cell counting kit-8(cck-8)、CFSE、Brd U、内皮细胞成管等实验,比较CD47缺失和WT小鼠内皮细胞增殖能力及功能,从而判断细胞衰老情况。随后我们对细胞进行连续传代培养,使用?-半乳糖苷酶(?-gal)染色(衰老细胞可被绿染),更直观地对比细胞的衰老水平。进而我们对两组细胞TSP1表达水平进行分析,明确TSP1表达在衰老细胞中的改变。接下来,我们对两组细胞的细胞周期及其相关细胞周期抑制剂p53、p21、p16,细胞周期激酶CDK4、CDK6、Cyclin D1,下游E2F通路分子CDK1、CDK2等进行分析,探究CD47对细胞衰老调控可能的机制。最后,为研究CD47-TSP1通路在内皮细胞衰老调控中的作用,我们分别单独加入TSP1及TSP1抗体,使用?-半乳糖苷酶染色、荧光定量等方法明确CD47-TSP1通路在内皮细胞衰老中的作用。结果显示:1、对CD47缺失及WT小鼠的血管内皮细胞进行cck-8、Brd U、CFSE等实验发现,与WT相比,CD47缺失组内皮细胞在相同生长时间内细胞数目、增殖细胞数目和分裂次数均更多,说明CD47缺失的内皮细胞增殖能力更强,而增殖能力强弱是细胞衰老水平判断的重要指标,间接说明CD47缺失的内皮细胞抵抗衰老的能力更强。2、通过体外成管实验(tube formation assay)发现,CD47缺失组内皮细胞无论在细胞年轻(第2代)还是年老(第6代)时,成管能力均较WT组明显增强;将CD47缺失和WT组内皮细胞分别与matrigel混合后打入小鼠皮下,发现CD47缺失组内皮细胞与matrigel形成的团块含有更多的红细胞及血管管腔,体外和体内实验均表明CD47缺失组内皮细胞功能较WT组更强。功能强弱同样代表细胞的衰老程度,因此更进一步说明CD47缺失的内皮细胞抵抗衰老的能力更强。3、随着细胞传代,衰老细胞(?-gal染色阳性)比例不断增多,细胞周期分析显示S期细胞比例不断降低,与WT组相比,CD47缺失组内皮细胞?-gal染色阳性率较低,S期比例相对较高,说明CD47缺失组中衰老比例较低,表明在同等传代次数下,CD47缺失的内皮细胞衰老得到延缓;在两组细胞中,TSP1表达均随细胞传代逐渐增多,说明TSP1可能在内皮细胞衰老中起重要作用,而CD47缺失组衰老程度较低,结合CD47为TSP1的重要受体考虑,推测CD47-TSP1通路可能在内皮细胞衰老中起到促进作用,而这一作用可能通过细胞周期的调控来实现。进一步对细胞周期抑制剂p53、p21、p16,细胞周期激酶CDK4、CDK6、Cyclin D1,下游E2F通路分子CDK1、CDK2等进行分析,发现p53、p21、p16在WT组中高表达,CDK4、CDK6、Cyclin D1,下游E2F通路分子CDK1、CDK2等在WT中低表达,推测CD47-TSP1通路通过调控细胞周期中的关键分子来达到控制细胞周期的目的,从而实现对内皮细胞衰老的调节。4、为证实TSP1在内皮细胞衰老中具有促进作用,我们在细胞培养体系中分别单独添加TSP1蛋白及TSP1抗体,结果发现在年轻细胞的中(第2代),WT组添加TSP1蛋白可使?-gal染色阳性细胞比例增加,细胞成管能力变差,说明TSP1可促进细胞衰老;在CD47缺失组中未观察到此类现象,表明TSP1的作用是CD47介导实现的。而第2代细胞中,无论WT还是CD47缺失组,未发现TSP1抗体的添加与对照相比有显著改变,考虑为2代细胞尚年轻的缘故,TSP1-CD47通路尚未充分激发。对年老细胞(第4代)添加TSP1抗体后发现,WT组?-gal染色阳性细胞比例显著降低,p53、p21、p16表达下降,CDK4、CDK6、Cyclin D1,下游E2F通路分子CDK1、CDK2等表达上升,说明拮抗TSP1作用可延缓细胞衰老,而CD47缺失组中未观察到此类现象,更进一步证实CD47-TSP1通路在内皮细胞衰老中的促进作用。综上所述,我们研究得到的结论是:CD47-TSP1通路在内皮细胞衰老中起促进作用,这一作用可能通过对细胞周期的调控来实现。CD47-TSP1通路对细胞周期的调控是通过调节细胞周期抑制剂p53、p21、p16,细胞周期激酶CDK4、CDK6、Cyclin D1等细胞周期中的关键分子来实现,CD47-TSP1通路可促进细胞周期抑制剂并抑制细胞周期激酶表达,从而抑制细胞周期进行,最终促进细胞衰老。研究结果表明,TSP1水平对心血管系统衰老程度具有提示作用,调控TSP1的表达在防治心血管疾病中具有重要意义。