论文部分内容阅读
大量野外及室内实验证明沉水植被释放的化感物质可明显抑制藻细胞的生长,而DNA损伤作为化感抑藻作用机理的重要组成部分,其检测则显得尤为重要。目前大多数DNA损伤方法是在动物及人体细胞的基础上建立的,而藻细胞DNA损伤方法则显得十分稀少,为建立适合藻细胞且灵敏的DNA损伤检测方法,本研究首先以聚球藻(Synechococcus elongatus PCC7942)为研究对象,探索并建立了对DNA构象敏感的qPCR技术以检测过氧化氢暴露下藻细胞中的DNA损伤;同时,以蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa FACHB-10)为研究对象,利用彗星实验检测化感物质焦性没食子酸暴露下,藻细胞的DNA损伤。本实验的主要研究结论如下: (1)成功建立对构象敏感的qPCR技术测定聚球藻的DNA损伤。选择DNA序列已测序完成的聚球藻PCC7942,一种重要的模式藻,作为qPCR方法构建的实验对象。在设计的9对引物中,通过多次的相对定量PCR实验,最终选择使用重复性较好且没有出现明显的非特异性扩增的L1和G4引物对,经过BLAST比对,确定通过L1和G4引物对扩增出的序列都是聚球藻内的单拷贝基因。连续10天培养聚球藻并取样,通过绝对定量实验,发现第6天的藻细胞中质粒的拷贝数较大且稳定,确定接种至第6天的藻细胞作为暴露的细胞样品。利用过氧化氢暴露聚球藻,测定其抑制聚球藻的EC50值,最终确定选择浓度为0 mM、1mM、2mM、3mM、4mM和5mM的过氧化氢暴露培养至第6天的聚球藻,暴露时间为2h、12h、24h和48 h。在同一时间点,随着过氧化氢浓度的升高,pANL质粒DNA的相对损伤及相对扩增差异存在明显升高具有剂量效应关系;同时在2h、12h和24 h的暴露期间还有明显的时间效应关系。同时定量PCR技术还可能进一步测定暴露条件下聚球藻基因组DNA的损伤,扩展了定量PCR技术的应用范围;实验还发现在添加了试剂araC/HU后,可明显提高低浓度暴露下qPCR技术的灵敏度,灵敏度提高了30倍。 (2)在过氧化氢的暴露下,聚球藻的生长受到明显的抑制,藻细胞的光合作用、代谢状态及细胞膜的完整性受到不同程度的影响。随着暴露浓度升高及暴露时间的延长,藻细胞膜的完整性不断被破坏,膜损伤的不断积累导致藻细胞的裂解死亡,从而使细胞的存活率明显降低。聚球藻细胞在过氧化氢暴露24 h内,叶绿素a荧光增强和酯酶活性提高,说明聚球藻通过增强光合作用和代谢途径应对胁迫;同时两者在48 h明显的下降表明,光合作用及代谢活动最终受到抑制。同时,藻细胞内的ROS水平在暴露12h内未出现明显变化,在暴露24 h时各浓度水平上细胞内ROS水平出现明显的上升,且具有浓度依赖效应,但暴露至48 h时,虽依然具有浓度效应,但对比24 h时的ROS水平有所回落。 (3)利用彗星实验检测焦性没食子酸暴露下蛋白核小球藻的DNA损伤。本实验中选择PA的暴露浓度低于72 h的EC50值,分别为50μM、100μM、150μM和200μM。暴露过程中,当蛋白核小球藻暴露于PA时,其光合作用最终受到抑制,同时酯酶活性显著降低。利用彗星实验测得蛋白核小球藻在PA暴露下,在各时间点DNA的损伤具有剂量依赖效应,同时在相同的浓度下,随着时间的延长DNA损伤明显上升,表明该方法可能用于检测抑藻物质对藻类的DNA损伤。