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谷氨酰胺合成酶（GS）是植物氮素同化途径中最为关键的催化酶之一，被认为是植物中无机氮转化为有机氮的“门户”，对植物氮素吸收、同化和利用效率有着极为重要的影响。植物中GS同工酶分为两种：一种是位于细胞质内的胞质型GS1，主要同化从土壤中吸收的初级氨及再同化植物体内各氮循环途径所释放的氨；另一种是位于叶绿体（或质体）内的质体型GS2，同化由NO3--N还原而来的氨及光呼吸过程中释放的氨。氮素供应对龙须菜生长发育和琼胶产量有着非常重要的影响，目前龙须菜氮代谢的研究还停留在氮营养生理层面，在分子机理水平的研究报道很少，尤其是对氮同化和利用效率紧密相关的GS基因的研究还是空白。 因此，本文以龙须菜（Gracilaria lemaneiformis）为实验对象，从龙须菜中克隆得到了3个谷氨酰胺合成酶基因，分别命名为GlGS1-1、GlGS1-2和GlGS2。利用生物信息学手段对其主要结构特征和功能特征进行了分析。GlGS2 cDNA全长1385bp，含有一个长1209bp，编码402个氨基酸的开放阅读框，推测的多肽分子量为43.9kDa。GlGS1-1全长为1209bp，开放阅读框长1053bp，编码350个氨基酸的多肽，推测的多肽分子量大小为38.3kDa。GlGS1-2cDNA全长1257bp，编码350个氨基酸的开放阅读框长1053bp，推测的多肽分子量大小为38.7kDa。氨基酸序列分析显示GlGS1-1、GlGS1-2和GlGS2蛋白具有植物GS同工酶的典型结构特征：内含一个GS beta-Grasp域和一个GS catalytic域，以及分别存在于这两个域中的两个活性中心：一个GS指纹区和一个GS ATP结合区。通过亚细胞定位预测GlGS1-1、GlGS1-2蛋白为胞质型蛋白，在GlGS2多肽N-端有一个27个氨基酸残基的转运肽，这个多肽定位于叶绿体内，表明GlGS2蛋白为叶绿体蛋白。系统进化树分析表明，GlGS2与一种单细胞红藻Galdieria sulphuraria的GS基因在分子进化关系上最相近，提示二者可能是同源进化的结果。GlGS1-1和GlGS1-2最相近，它们可能由某一共同祖先基因经重复和突变产生。 为了对龙须菜GlGS2所编码的GS酶的生化功能和属性有准确的了解，本实验将GlGS2去除跨肽cTP序列的GlGS2编码区（GlGS2-cTP）插入到载体pET30a(+)中，成功构建表达载体GlGS2-cTP-pET30a(+)，转化大肠杆菌BL21（DE3），0.25mM IPTG诱导，在15℃培养过夜，菌体表达活性蛋白量最大。用Ni-NTA亲和色谱法纯化得到了各对应的重组蛋白。SDS-PAGE电泳结果显示，重组的去除跨肽cTP序列的GlGS2编码区蛋白的分子量为43kDa左右。分析重组蛋白质的谷氨酰胺合成酶催化特性显示，获得的重组蛋白具有GS酶催化活性，在实验设定的温度和pH范围内，其最适温度为37℃，最适pH为7.4，进一步在蛋白质水平证实GlGS2为谷氨酰胺合成酶基因。 本文以龙须菜为材料，在50μmol/L氮源（NH4+-N:NO3--N=2:1）配制的人工海水中预培养两周。设置不同氮形态比例的氮源：NH4+-N:NO3-N分别为50:0、40:10、25:25、10:40、0:50。取材并提取总RNA，用实时荧光定量PCR方法测定龙须菜GlGS2、GlGS1-1、GlGS1-2 mRNA的相对表达水平，分析不同NH4+-N:NO3--N比例的氮源施养处理对龙须菜GlGS2、GlGS1-1和GlGS1-2表达的调控作用。结果显示不同形态比例的氮源对龙须菜GlGS2、GlGS1-1、GlGS1-2的表达呈现不同的调节模式。总体来看，NH4+-N会促进GlGS2的表达，而NO3--N则会促进GlGS1-1和GlGS1-2的表达。