论文部分内容阅读
第一部分木鳖子对羟基桂皮醛抑制食管鳞癌细胞增殖和诱导细胞凋亡的研究背景与目的:本课题组前期研究显示,木鳖子单体化合物、粗提物及中药复方均可有效抑制乳腺癌、肺癌、胃癌等肿瘤细胞的生长,本研究旨在探究木鳖子乙醇相提取物木鳖子对羟基桂皮醛（p-Hydroxylcinnamaldehyde from cochinchina momordica seed,CMSP）对食管鳞状细胞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）细胞增殖和凋亡的影响。方法:1.应用倒置相差显微镜观察10-80μg/mL CMSP作用ESCC细胞KYSE-30和Eca-109 48 h后,对其细胞形态的影响。2.应用MTS法检测10-80μg/mL CMSP对ESCC细胞KYSE-30和Eca-109增殖的影响。3.应用克隆形成实验检测10-40μg/mL CMSP对ESCC细胞KYSE-30和Eca-109的克隆形成能力的影响。4.应用流式细胞术检测20-80μg/mL CMSP作用ESCC细胞KYSE-30、KYSE-150和Eca-109 48h后对其凋亡的影响。5.应用Western blotting技术检测20-80μg/mL CMSP对ESCC细胞KYSE-30和Eca-109中凋亡相关蛋白表达水平的影响。结果:1.倒置相差显微镜观察显示,随着CMSP浓度升高,尤其是40-80μg/mL CMSP作用于KYSE-30和Eca-109细胞后,细胞空泡增多、细胞脱落明显且细胞呈不规则形态改变。2.MTS法检测结果显示,低浓度的CMSP（10和20μg/mL）对ESCC细胞的增殖抑制作用不明显;而高浓度的CMSP（40、60和80μg/mL）对食管癌细胞KYSE-30和Eca-109的细胞增殖活性有明显抑制作用,且呈剂量依赖性（P＜0.05）。3.克隆形成实验显示,与10-40μg/mL CMSP共培养的KYSE-30和Eca-109细胞,其克隆形成能力明显下降,且呈剂量依赖性。4.Annexin V-PE/7-AAD联合流式细胞术分析结果显示,60和80μg/mL CMSP作用48 h时可明显诱导KYSE-30细胞凋亡、20-80μg/mL CMSP可显著诱导KYSE-150和Eca-109细胞凋亡,且呈剂量依赖性（P＜0.05）。5.Western blotting结果显示,20-80μg/mL CMSP处理48 h后,可以显著增加KYSE-30和Eca-109细胞中凋亡相关蛋白cleaved caspase3、cleaved caspase8和cleaved caspase9的表达水平（P＜0.05）。小结:CMSP通过抑制ESCC细胞的增殖活性、促进ESCC细胞的凋亡,从而发挥抗肿瘤作用。第二部分木鳖子对羟基桂皮醛抑制食管鳞状细胞癌自噬的研究目的:探究不同浓度的木鳖子对羟基桂皮醛对食管鳞癌细胞自噬的影响。方法:1.转染eGFP-LC3B质粒后,使用40和60μg/mL CMSP及20μM氯喹（Chloroquine,CQ）处理ESCC细胞KYSE-30和Eca-109 24 h后,应用激光共聚焦显微镜观察CMSP对自噬小体的影响。2.应用透射电子显微镜观察阴性对照组和40μg/mL CMSP作用KYSE-30细胞48 h后,自噬小体的生成和组间差异。3.应用Western blotting技术检测不同浓度CMSP处理ESCC细胞KYSE-30和Eca-109 48 h后,自噬相关蛋白LCB、P62、ATG5和ATG7表达水平的改变。4.转染mRFP-eGFP-LC3B质粒后,使用40和60μg/mL CMSP及20μM氯喹（Chloroquine,CQ）处理ESCC细胞KYSE-30和Eca-109 24 h后,应用激光共聚焦显微镜观察CMSP对ESCC细胞自噬流的影响。结果:1.转染eGFP-LC3B质粒后,与阴性对照组相比,使用40和60μg/mL CMSP处理KYSE-30和Eca-109细胞48 h后,绿色GFP荧光斑点增多表明细胞内自噬小体增多（P＜0.05）。2.使用透射电子显微镜观察,发现40μg/mL CMSP处理KYSE-30细胞48 h后细胞内自噬小体增多,而在阴性对照组中未见自噬小体。3.Western blotting实验结果显示,CMSP处理KYSE-30和Eca-109细胞48h后,自噬相关蛋白LC3B、P62、ATG5和ATG7的表达水平均升高（P＜0.05）,表明CMSP导致了自噬小体在体内堆积从而抑制自噬流。4.转染了mRFP-eGFP-LC3B双荧光质粒,因为绿色荧光GFP在酸性溶酶体中发生猝灭,因此红色斑点RFP代表自噬溶酶体,而融合的黄色斑点代表自噬小体。结果表明,CMSP处理后,ESCC细胞在双荧光体系下检测黄色斑点数量均显著增多（P＜0.05）,而红色斑点数量没有明显变化;在阳性对照组CQ处理组中,也出现了黄色斑点数量明显增多（P＜0.05）,而红色斑点数量没有明显变化。表明CMSP通过阻滞自噬体和溶酶体的融合从而抑制自噬流。小结:CMSP通过阻断自噬体和溶酶体的融合,抑制自噬流从而抑制ESCC细胞的自噬水平。第三部分木鳖子对羟基桂皮醛通过调控AMPK-mTOR-ULK1信号轴调控食管癌细胞自噬诱导细胞凋亡目的:探讨CMSP调控食管癌细胞自噬进而诱导细胞凋亡的机制。方法:1.40μg/mL CMSP处理KYSE-30细胞48 h小时后利用高效液相色谱-质谱联合技术（Liquid chromatography-Mass spectrometry,LC-MS）检测发生变化的差异蛋白。2.20-80μg/mL CMSP作用于ESCC细胞KYSE-30和Eca-109 48 h后,Western blotting实验检测ULK1蛋白的表达水平的改变;40μg/mL CMSP作用于KYSE-150和Eca-109细胞1、3、6、12、24、48小时后,检测AMPKα、p-AMPKα（Thr172）、P70s6k、p-P70S6K（The389/412）、LC3B以及P62蛋白的表达水平改变。3.40μg/mL CMSP分别与自噬抑制剂CQ或自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）联用48 h后,应用光学显微镜检测ESCC细胞KYSE-30和Eca-109形态的改变。4.应用MTS法检测40μg/mL CMSP分别与自噬抑制剂CQ和自噬激活剂Rapamycin联用48 h后,对ESCC细胞KYSE-30和Eca-109增殖的影响。结果:1.液相色谱-质谱分析结果显示,与对照组相比,40μg/mL CMSP处理组KYSE-30细胞中有182种蛋白表达水平发生明显变化,将这些蛋白进行KEGG通路分析,富集分析结果显示,CMSP可能通过AMPK信号通路调控细胞功能。2.Western blot实验结果显示,CMSP可以通过AMPK/mTOR/ULK1信号轴调控ESCC细胞KYSE-30和Eca-109的自噬（P＜0.05）。3.通过显微镜观察发现,40μg/mL CMSP与自噬抑制剂CQ联用显著促进细胞呈凋亡状改变,而40μg/mL CMSP与自噬激活剂雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）联用可以部分恢复CMSP单独使用对ESCC细胞形态造成的影响。4.MTS法检测结果显示,与40μg/mL CMSP单独处理组相比,CMSP与自噬抑制剂CQ联用可以显著增强CMSP对ESCC细胞的增殖抑制作用（P＜0.05）,而CMSP与自噬激活剂Rapa联用可以部分恢复CMSP对ESCC细胞的增殖抑制作用（P＜0.05）。小结:通过差异蛋白质谱分析及相关验证实验发现,CMSP可能通过AMPK/mTOR/ULK1信号通路调控食管鳞状细胞癌的自噬和凋亡;结论:CMSP可以抑制ESCC细胞的增殖能力,诱导细胞凋亡,可以通过调控AMPK-mTOR-ULK1信号轴阻止自噬体和溶酶体的融合从而抑制自噬流,并且通过调控细胞自噬诱导细胞凋亡,从而阻止肿瘤的发展,发挥抗肿瘤作用。因此,CMSP作为一种抗癌药物具有很大的研究空间和应用价值。