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背景:原发性肝癌是我国最常见的恶性肿瘤之一,按病理类型分为肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma,HCC）、肝内胆管癌（Intrahepatic Cholangiocarcinoma,ICC）和HCC-ICC混合型[1-2]。肿瘤的研究主要基于基因组的不稳定性,随着肿瘤分子生物学研究的深入,逐渐出现了一些新的普遍性特征。肿瘤新的标志主要包括以下6个方面:维持增殖信号,无限复制,抵抗细胞死亡,侵袭性和转移性,血管新生,逃避生长抑制因子。这6个标志都基于基因组的不稳定性[3]。1924年德国著名生物化学家﹑诺贝尔生理医学奖获得者奥托·瓦伯格（Otto Warburg）发现肿瘤的一个新标志:正常情况下,细胞中的葡萄糖通过有氧氧化途径产生ATP,但在肿瘤细胞中葡萄糖通过有氧糖酵解途径产生ATP,这就是著名的瓦伯格效应。代谢研究的兴起从一个新的维度解释了肿瘤的发生发展,是肿瘤的一个新标志[4-6]。代谢酶的研究是肿瘤代谢中的一个热点问题,近年来肿瘤有氧糖酵解的研究一直是糖代谢研究的重点内容,而糖酵解的逆过程糖异生却很少研究。糖异生是合成葡萄糖和糖原的一个过程,主要利用一系列糖异生酶催化简单的非糖前体（乳酸、甘油、生糖氨基酸等）一步一步合成葡萄糖和糖原[7]。果糖-1,6-二磷酸酶（fructose-1,6-bisphosphatase,FBPase）是糖异生途径第二步限速反应中的关键酶,不可逆地将果糖-1,6-二磷酸催化转变成果糖-6-磷酸。人有两种基因编码的果糖-1,6-二磷酸酶,FBP1和FBP2。FBP1存在于肝肾组织中,并且是糖异生的限速酶。FBP2则只存在于肌肉组织中。磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（Phosphoenolpyruvate carboxykinase,PCK）是糖异生反应的第一个关键酶,催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。人有两种基因编码的磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶,即PCK1和PCK2,PCK1存在于细胞质中,PCK2存在于线粒体中,两者都为糖异生的关键酶[8-12]。FBP1和PCK1都可以对抗肿瘤的有氧糖酵解。最近的研究表明,除了代谢调节外,这两个酶还可以通过影响转录、表观遗传学、翻译后修饰和酶活性等方面参与调控肿瘤细胞的信号转导、增殖[22]。代谢和自噬近几年已经成为肿瘤研究的热点。自噬是一个降解细胞内蛋白质和细胞器的过程,首先细胞自身的细胞质蛋白和细胞器被囊泡逐渐包被,然后与溶酶体融合形成自噬溶酶体,最后降解被包裹的内容物（蛋白质和细胞器）。自噬与肿瘤的关系非常密切,自噬既可以促进肿瘤细胞的死亡又可以抵抗肿瘤细胞的死亡[13-15]。已有文章证明糖异生中的关键酶葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase,G6PC）可以调控自噬的水平,但在肝癌中FBP1调控自噬的研究还尚未报道[16-17]。本课题首先观察了糖异生关键酶FBP1在临床肝癌组织标本、肝癌细胞系中的表达情况,通过细胞体外实验证实过表达FBP1抑制肝癌的自噬及增殖,并发现在过表达FBP1的肝癌细胞中进行低糖处理后发生明显凋亡。成功建立肝脏特异性PCK1敲除小鼠,为体内研究PCK1在肝癌中的作用机制奠定基础。上述实验将有助于我们深入了解糖异生关键酶FBP1和PCK1在肝癌发生发展中的作用,有助于从代谢角度出发为防治肝癌提供新的策略。实验方法:1、在TCGA（The Cancer Genome Atlas）数据库中分析肝癌组织与癌旁组织中FBP1的表达情况,分析FBP1表达量与患者预后之间的关系。通过提取临床肝癌组织和癌旁组织标本的蛋白,利用Western blot技术检测FBP1的表达情况。通过提取正常肝细胞和不同肝癌细胞系的蛋白,利用Western blot技术检测FBP1的表达情况。2.获得过表达FBP1的肝癌细胞模型。构建FBP1腺病毒重组质粒,利用AdEasy腺病毒载体系统构建过表达FBP1重组腺病毒表达载体,通过Western blot技术鉴定FBP1重组腺病毒的过表达效率。3.在肝癌细胞系和临床肝癌组织中分析FBP1对自噬水平的影响:利用Western Blot技术和激光共聚焦技术观察FBP1对肝癌细胞自噬水平的影响。利用Western blot技术检测自噬指标LC3在临床肝癌和癌旁组织中的表达情况。4.通过体外细胞观察实验检测FBP1对肝癌细胞系增殖和凋亡的影响。通过克隆形成实验和MTS实验观察FBP1对肝癌细胞增殖能力的影响,最后通过细胞凋亡实验和Western Blot实验检测低糖处理后FBP1对肝癌细胞凋亡的影响。5.构建PCK1肝脏特异性敲除小鼠肝癌模型:首先用AlbCre小鼠与PCK1loxP/loxP小鼠交配获得肝脏特异性PCK1敲除小鼠(AlbCre/PCK1loxP/loxP),然后用二乙基亚硝胺/四氯化碳诱导小鼠肝癌模型,从而观察PCK1敲除对小鼠肝癌发生发展的影响。结果:1.TCGA数据库分析发现,肝癌组织中FBP1的表达与癌旁组织相比明显降低（P<0.01）,并且HCC患者中低表达FBP1的患者生存期显著低于高表达FBP1的患者。Western blot结果发现12对肿瘤组织标本中有9对FBP1蛋白表达呈下调趋势,占66.6%。Western blot结果发现在肝癌细胞中FBP1的表达低于正常肝细胞。2.成功构建FBP1腺病毒重组质粒,并包装成高滴度腺病毒,Western blot方法鉴定FBP1重组腺病毒构建成功。3.Western Blot结果显示,过表达FBP1的肝癌细胞自噬指标LC3的水平明显降低。激光共聚焦检测结果表明,过表达FBP1的肝癌细胞的自噬体数量明显下降。9对FBP1低表达的肝癌组织标本中有8对自噬指标LC3的水平高于癌旁组织。4.MTS实验和克隆形成实验结果显示,过表达FBP1的肝癌细胞其增殖能力明显被抑制,Western Blot实验和细胞凋亡实验结果显示,低糖处理后过表达FBP1组的肝癌细胞发生明显凋亡。5.成功构建PCK1肝脏特异性敲除小鼠肝癌模型。结论:在本研究中,我们首先发现了FBP1在肝癌组织中低表达,然后在细胞体外实验中证明FBP1可以抑制肝癌细胞的自噬及增殖,并证明过表达FBP1促进肝癌细胞的凋亡。成功构建PCK1肝脏特异性敲除小鼠肝癌模型,并证实PCK1敲除能促进肝癌的发生发展。