卵巢内卵泡的发育是卵巢内分泌及旁分泌影响下协调发展的过程，卵巢的颗粒细胞围绕在卵母细胞周围对随后的卵泡发育、排卵、卵子受精及胚胎种植发挥重要的作用。在卵泡的生长发育过程中，一簇窦卵泡中仅选择出一个主导卵泡，而大多数卵泡则发生闭锁（凋亡）。颗粒细胞经过有丝分裂（增殖），随后获得促性腺激素受体具备生成甾体激素的能力（分化），排卵前卵泡的颗粒细胞对黄体的形成有重要的作用，而未排卵的卵泡的颗粒细胞则发生凋亡。卵泡闭锁过程中颗粒细胞的凋亡发挥重要的作用，不仅窦卵泡发生闭锁，所有发育阶段的卵泡均可发生闭锁，颗粒细胞的普遍命运是凋亡。已有研究表明颗粒细胞的增殖凋亡状态可影响卵泡的发育，卵母细胞的质量及后续的胚胎发育。迄今，参与调控颗粒细胞增殖凋亡的基因表达及分子机制尚不十分清楚，因此全面探讨颗粒细胞增殖、凋亡及其相关基因的表达对进一步明确颗粒细胞功能状态对于卵母细胞的命运、卵巢的功能的影响有重要意义。　　 卵巢颗粒细胞的增殖、分化、凋亡的机制及其调控非常复杂，牵涉到复杂的分子作用机制和信号转导通路。钾离子通道是目前发现的亚型数目最多的一类细胞膜离子通道，在调控细胞动作电位的形成、膜复极化、维持静息电位的水平以及在细胞的分泌和肌细胞的紧张等一系列细胞生理活动方面起着重要作用，是生物电活动的基础，在细胞内和细胞间信号传递中起着重要作用。研究发现卵巢颗粒细胞存在电压依赖的钾离子通道，颗粒细胞电活动的调节为研究其细胞功能提供了一种新方法，颗粒细胞的去极化是卵母细胞成熟的重要特征，通过电耦相连的颗粒细胞和卵母细胞之间的联系可能代表了一种重要的信号传导通路，但迄今为止，颗粒细胞功能与钾离子通道信号通路之间的关系仍不清楚。　　 基于上述，本课题以此为切入点进行深入研究，第一、二部分首先通过检测人卵巢黄素化颗粒细胞增殖、凋亡相关基因的表达情况，探讨并明确颗粒细胞增殖、凋亡状态及相关基因的表达在卵泡发育中的作用及对卵巢功能的影响，第三部分从钾离子通道水平对颗粒细胞进行深入研究，探求颗粒细胞钾离子通道被选择性阻滞剂4-氨基吡啶（4-AP）阻滞后，颗粒细胞的增殖、凋亡及孕激素分泌的改变及其可能的作用机制，以期为颗粒细胞功能调控与卵泡发育、闭锁及卵母细胞成熟等生理、病理学问题提供一些理论基础，对不孕症的诊断和防治提供新思路。　　 第一部分：人卵巢黄素化颗粒细胞细胞周期蛋白D2的表达与卵巢功能的相关性研究　　 目的：通过检测人卵巢黄素化颗粒细胞细胞周期蛋白D2（cyclin D2）及mRNA的表达，并以增殖细胞核抗原标记指数（PCNA-LI）作为颗粒细胞（GC）增殖活性参数，初步探索cyclin D2的表达在卵母细胞发育成熟进程中的作用及对妊娠结局的影响，探讨颗粒细胞的增殖状态对卵巢生殖功能的影响。　　 方法：收集32例行体外受精.胚胎移植（IVF-ET）患者的卵巢黄素化颗粒细胞，根据取卵时卵泡发育数不同将卵巢反应性分为为高反应组（卵泡直径16mm以上的卵泡数≥20个）、中反应组（卵泡数5-19个）及低反应组（卵泡数≤4个）。采用免疫细胞化学方法检测颗粒细胞膜上细胞cyclin D2及PCNA蛋白的表达；逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测颗粒细胞cyclin D2 mRNA的表达水平；化学发光法测定基础血清FSH，HCG日E2水平。分析颗粒细胞cyclin D2 mRNA及蛋白的表达与IVF临床参数（年龄、基础FSH水平、促性腺激素的用量、HCG日E2水平、获卵数、卵巢反应性及妊娠结局）的关系以及和颗粒细胞增殖活性（PCNA标记指数）的相关性。　　 结论：（1）体外培养的人卵巢黄素化颗粒细胞存在cyclin D2 mRNA及蛋白的表达。（2）黄素化颗粒细胞cyclin D2 mRNA及蛋白的表达与年龄、基础FSH呈负相关，与获卵数及HCG日E2水平呈正相关，提示cyclin D2的表达可反映卵巢储备功能。（3）黄素化颗粒细胞cyclin D2 mRNA及蛋白的表达随着卵巢反应性的增高而增强，提示cyclin D2的表达与卵巢反应性正相关。（4）黄素化颗粒细胞cyclin D2的表达与颗粒细胞的PCNA标记指数显著正相关，进一步提示cyclin D2的表达与卵巢颗粒细胞的增殖活性密切相关，cyclin D2可能通过调节颗粒细胞的增殖分化参与卵泡的发育。　　 第二部分：人黄素化卵巢颗粒细胞凋亡及其相关基因的表达与卵巢功能的相关性研究　　 目的：通过检测人卵巢黄素化颗粒细胞的凋亡及其相关基因的表达，全面探讨颗粒细胞凋亡对于卵巢功能及卵巢反应性的影响，进一步明确颗粒细胞凋亡对于卵母细胞的命运、卵巢的功能的内在调控机制。　　 方法：收集32例行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）或卵胞浆内单精子注射（ICSI）患者的卵巢黄素化颗粒细胞，根据取卵时卵泡发育数不同将卵巢反应性分为为高反应组（卵泡直径16mm以上的卵泡数≥20个）、中反应组（卵泡数5-19个）及低反应组（卵泡数≤4个）。应用流式细胞仪AnnexinV-PI双染法检测颗粒细胞凋亡，同时利用新型荧光探针JC-1标记颗粒细胞线粒体，流式细胞仪测定细胞线粒体跨膜电位。采用免疫细胞化学方法检测颗粒细胞膜上细胞survivin蛋白的表达，逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测颗粒细胞survivin mRNA的表达水平。分光光度法检测颗粒细胞内caspase-3活性。化学发光法测定基础血清FSH，HCG日E2水平。分析颗粒细胞的凋亡及其相关基因的表达与IVF临床参数（年龄、基础FSH水平、促性腺激素的用量、HCG日E2水平、获卵数、卵巢反应性及妊娠结局）的关系。　　 结论：（1）黄素化颗粒细胞的凋亡率可反映卵巢储备功能与卵巢反应性，并与优质胚胎率及妊娠结局呈负相关，提示颗粒细胞的凋亡可能影响卵巢功能及胚胎的体外发育潜能。（2）黄素化颗粒细胞线粒体膜电位与优质胚胎率、妊娠率呈正相关，其下降可反映颗粒细胞的凋亡，提示颗粒细胞的线粒体内膜完整性可能影响卵母细胞的质量及妊娠结局。（3）黄素化颗粒细胞存在survivin mRNA及蛋白的表达，其表达水平可反映卵巢储备功能与卵巢反应性，并与优质胚胎率呈显著正相关，提示survivin的表达在颗粒细胞的凋亡过程中发挥重要作用，其可能通过降低caspase-3活性抑制颗粒细胞凋亡，从而影响卵巢的功能及胚胎的发育潜能。　　 第三部分：钾离子通道阻滞剂对人卵巢黄素化颗粒细胞增殖、凋亡及孕酮分泌影响的研究　　 目的：探讨钾通道阻滞剂4-氨基比啶（4-AP）对人黄素化颗粒细胞增殖、凋亡及孕酮分泌的影响及其可能的机制。　　 方法：收集行体外受精-胚胎移植患者的卵巢黄素化颗粒细胞，分别加入不同浓度的4-AP（0、0、5、10mmol/L）进行体外培养24小时，采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法检测不同浓度4-AP对颗粒细胞增殖的影响；应用流式细胞仪AnnexinV-PI双染法检测颗粒细胞凋亡；同时利用新型荧光探针JC-1标记颗粒细胞线粒体，流式细胞仪测定细胞线粒体跨膜电位的变化；化学发光法测定4-AP对于基础状态（HCG=0IU/L）及HCG诱导状态下（HCG=1250IU/L）孕酮分泌的影响；采用放射免疫测定法（RLA）检测细胞内cAMP浓度。应用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）及蛋白印记技术（Western blotting）检测颗粒细胞内增殖、凋亡及激素生成相关基因（cyclinD2，PCNA，Survivin.StAR）的mRNA和蛋白表达情况。　　 结论：（1）4-AP以时间剂量依赖的方式抑制人黄素化颗粒细胞的增殖，4-AP可能是通过降低cyclinD2和PCNA的表达，使细胞周期进展阻滞，从而抑制颗粒细胞的增殖。（2）4-AP可诱导人黄素化颗粒细胞的凋亡，4-AP作用后颗粒细胞凋亡率增高，线粒体膜电位下降，细胞内caspase-3的活性较基础状态明显增高，同时survivin表达下降。（3）4-AP抑制人卵巢颗粒细胞孕酮的分泌，可能与cAMP产生减少和StAR表达降低有关。　　 综上所述，研究发现：（1）体外培养的人卵巢黄素化颗粒细胞cyclin D2的表达与卵巢的功能及促排卵过程中卵巢的反应性有关。cyclin D2的表达代表了卵巢颗粒细胞的增殖活性，cyclin D2可能通过调节颗粒细胞的增殖分化参与卵泡的发育。（2）黄素化颗粒细胞的凋亡及线粒体内膜的完整性可能影响卵巢功能及胚胎的体外发育潜能；凋亡相关基因Survivin可能在颗粒细胞的凋亡过程中发挥重要作用，其可能通过降低caspase-3活性抑制颗粒细胞凋亡，从而影响卵巢的功能及胚胎的发育。（3）钾离子通道阻滞剂4-AP以时间剂量依赖的方式抑制人黄素化颗粒细胞的增殖及孕激素的分泌，同时诱导其凋亡，提示钾离子通道作为一种新的信号转导通道可能在卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及孕激素分泌过程中发挥一定作用。