类胡萝卜素作为一类具有重要功能的脂溶性色素,广泛分布于自然界中,其营养价值高,具有抗癌、抗氧化、抗心脑血管疾病等功效。因此,已被广泛应用到食品、饲料、保健品及化妆品等行业。尽管许多研究者已经对如何提高类胡萝卜素的产量进行了大量的研究,但类胡萝卜素的产量和质量仍远远不能满足人们的需求。目前,类胡萝卜素的生产方法包括化学合成法和生物转化法。化学合成法生产类胡萝卜素虽然成本小,但是生物活性低,另因其毒副作用,已被限制使用。而生物法比化学法合成的类胡萝卜素具有很大产品质量优势。本文的研究对象是红冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235,作为酵母类微生物,它具有生产周期短、遗传稳定、生产安全等优点。酵母类微生物中少部分能够自身合成类胡萝卜素的菌株,如红法夫酵母(Phaffia rhodozyma)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis),它们合成类胡萝卜素的前体物质是法尼基焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)。参与FPP转化合成类胡萝卜素的过程的关键酶主要有GGPP合成酶(编码基因:crtE)、八氢番茄红素脱氢酶(编码基因:crtI)以及一种双功能酶:八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶(编码基因:crtYB)。在这些酶的作用下,产类胡萝卜素酵母将前体物质FPP依次转化为八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素三种类胡萝卜素,其中β-胡萝卜素是该途径中重要的终产物,通常作为检测类胡萝卜素含量的指标。因此,类胡萝卜素合成关键酶基因是本文的研究重点。此外,在植物和微生物类胡萝卜素合成研究中,国内外均有研究表明:低温条件胁迫下,多种植物和微生物在类胡萝卜素合成上存在显著的差异。红冬孢酵母YM25235在低温培养条件下菌落颜色显著加深,所以我们预测红冬孢酵母中类胡萝卜素合成与其低温生长适应性机制存在一定联系。首先我们对红冬孢酵母YM25235细胞内的色素进行提取、分离与鉴定,确定了该菌株具有合成番茄红素和β-胡萝卜素这两种类胡萝卜素的功能。为了找到红冬孢酵母YM25235菌株中类胡萝卜素合成相关基因(如关键酶基因),我们在红冬孢酵母YM25235转录组测序的基础上,对其序列进行生物信息学分析,发现了两个潜在的类胡萝卜素合成关键酶基因序列:Pdh和Lc。于是我们分别将Pdh和Lc基因的cDNA片段插入pRH2304载体的特定位置,得到重组表达质粒pRHPdh、pRHLc。然后将这两个过表达质粒转入红冬孢酵母YM25235进行过表达,并检测过表达菌株中Pdh和Lc基因的表达水平以及终产物β-胡萝卜素合成量与对照菌株(含空质粒PRH2304的YM25235菌株)的差异。结果是,过表达菌株pRHPdh中Pdh基因表达水平是对照1.8倍,Lc基因的表达水平是对照的1.2倍,β-胡萝卜素的合成量是对照菌的1.38倍;过表达菌株pRHLc中Pdh基因表达量是对照的1.4倍,Lc基因的表达量是对照的3.9倍,β-胡萝卜素的合成量是对照菌的1.90倍。说明在红冬孢酵母YM25235中导入外源Pdh和Lc基因,都能提高这两个基因的表达水平并最终促进类胡萝卜素的合成,即Pdh和Lc基因的过表达均能促进红冬孢酵母YM25235中类胡萝卜素的合成。HisK2301、Rkhog1和MSN4三个基因是红冬孢酵母YM25235中低温生长适应的调调控基因,为了研究低温条件下Pdh和Lc基因转录水平与上述三个基因转录水平之间的相互关系以及这种关系与低温生长适应性机制的联系,我们同样对低温(15℃)培养条件下的过表达菌株pRHHisK2301、过表达菌株pRHRkhog1和表达菌株pRHMSN4进行了Pdh和Lc基因的表达水平以及β-胡萝卜素合成量的检测分析,结果显示:15℃培养条件下,过表达菌株pRHHisK2301中Pdh基因表达量是对照的2.5倍,Lc的表达量是对照的2.4倍,β-胡萝卜素的合成量是对照菌的1.37倍;过表达菌株pRHRkhog1中Pdh基因表达量是对照的3.4倍,Lc的表达量是对照的2.9倍,.β-胡萝卜素的合成量是对照菌的1.89倍;过表达菌株pRHMSN4中Pdh基因表达量是对照的2.6倍,Lc的表达量是对照的2.3倍,β-胡萝卜素的合成量是对照菌的2.00倍。说明HisK2301、Rkhog1、MSN4基因的过表达,均能提高红冬孢酵母YM25235中Pdh和Lc基因的表达水平并最终促进类胡萝卜素的合成。又因为15℃条件下过表达菌株pRHHisK2301中HisK2301基因、过表达菌株pRHRkhog1中的Rkhog1基因和表达菌株pRHMSN4中MSN4基因的表达水平都有上升,说明红冬胞酵母YM25235的低温生长适应性促进其类胡萝卜素的合成。总之,本研究获得了红冬胞酵母YM25235中两个类胡萝卜素合成相关基因Pdh和Lc,它们编码的蛋白能够促进其自身类胡萝卜素的合成;红冬孢酵母YM25235合成类胡萝卜素的过程与其低温生长适应性机制有关,这一调节机制可以促进低温条件下类胡萝卜素的合成。本研究成果有助于进一步揭示真菌中β-胡萝卜素合成的调节机制,为今后大规模利用酵母生产β-胡萝卜素的研究与应用奠定基础。