论文部分内容阅读
目的探索小鼠胚芽干细胞(Embryonic Germ Cells, EGCs)分离、培养的有效方法；观察激活态雪旺细胞(Activated Schwann cells, ASCs)源性神经营养因子对小鼠EGCs句神经细胞分化的影响。方法分离受精11天小鼠生殖腺嵴及同时取少量的腹壁组织共同消化培养,经质量分数0.125%胰蛋白酶-0.02%EDTA消化制备成胚芽干细胞悬液,将细胞种植在饲养层(经丝裂霉素C处理过的胎鼠成纤维细胞)细胞上。观察小鼠EGCs集落形成情况,并采用阶段特异性胚胎抗原-1(Stage Specificity Embryo Antigen-1, SSEA-1),碱性磷酸酶染色(Alkaline Phosphatase, AKP),过碘酸-雪大染色(Periodic Acid-Schiff staining, PAS)对其进行鉴定。采用双酶消化组织块法结合机械分离法分离培养ASCs。将神经诱导实验分为：基础培养基+小鼠EGCs (空白对照组)；ASCs培养基与小鼠EGCs共培养(实验组)；培养3周后对神经诱导结果进行神经元特异性核蛋白(Neuron-specific Nuclear Protein, NeuN),髓鞘相关蛋白(Myelin Basic Protein, MBP),胶质纤维酸性蛋白(Glial Fibril lary Acidic Protein, GFAP)免疫荧光染色鉴定、统计细胞染色阳性率,对实验结果进行统计学分析。结果(1)小鼠EGCs的鉴定：呈集落性生长,集落隆起、多数呈鸟巢状、与周围的饲养层细胞存在明显界限；集落内的细胞密集,呈现一个或几个核仁、核质比高的圆形或卵圆形；阶段特异性胚胎抗原-1染色、碱性磷酸酶染色、过碘酸-雪夫染色均阳性；(2)小鼠EGCs神经诱导：诱导3周后,在倒置显微镜下：观察到细胞伸出类似轴突的细长突起,部分胞体变大,伸出的轴突和树突交织在一起；NeuN, MBP, GFAP免疫荧光染色结果阳性；细胞染色阳性率比较显示差异具有统计学意义。结论本实验通过一种简单、经济的方法,体外成功分离获得小鼠EGCs;ASCs可以分泌多种神经营养因子并能够促进小鼠EGCs在体外向神经细胞分化。