【摘 要】
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干酪因其细腻的口感、丰富的营养价值和便于保存、运输等优点,在乳制品行业占据重要的地位。凝乳酶作为干酪生产过程中关键的酶制剂,需求量也不断的在增加,传统型动物来源的凝乳酶已难以满足人类的需求。目前,凝乳酶的来源主要分为三种:动物性来源、植物性来源以及微生物性来源。其中,微生物来源的凝乳酶由于其低廉的生产成本及良好的性能,成为主要的动物源凝乳酶替代品。尤其通过基因工程改造而来的凝乳酶与天然凝乳酶相比其
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干酪因其细腻的口感、丰富的营养价值和便于保存、运输等优点,在乳制品行业占据重要的地位。凝乳酶作为干酪生产过程中关键的酶制剂,需求量也不断的在增加,传统型动物来源的凝乳酶已难以满足人类的需求。目前,凝乳酶的来源主要分为三种:动物性来源、植物性来源以及微生物性来源。其中,微生物来源的凝乳酶由于其低廉的生产成本及良好的性能,成为主要的动物源凝乳酶替代品。尤其通过基因工程改造而来的凝乳酶与天然凝乳酶相比其性能几乎没有差异。目前,许多宿主细胞已经广泛的被用于重组蛋白的生产,包括一些原核细胞、酵母以及一些动植物细胞。黑曲霉（Aspergillus niger）被誉为重组蛋白的生产加工工厂,是表达食品级蛋白质的理想选择。黑曲霉具有生产成本低廉、强大的翻译后加工机制以及高效的分泌能力等优点,是美国FDA所认证的食品级安全菌株。但黑曲霉在表达外源蛋白时,其产量往往相比于内源蛋白较差。本实验室前期应用黑曲霉表达系统表达了牛凝乳酶原,但是表达量较低,并且需要在强酸条件下自动催化激活。为解决以上问题,本研究尝试在黑曲霉中表达成熟牛凝乳酶。为提高成熟牛凝乳酶在黑曲霉中的表达量,我们在牛凝乳酶C端融合了五聚赖氨酸（5K）、五聚天冬氨酸（5D）、五聚天冬酰胺（5N）等3种不同带电性的极性短肽标签。取得的主要研究结果如下:通过设计成熟牛凝乳酶基因（cym）上下游引物,以实验室前期保存的牛凝乳酶基因为模板,克隆了融合有极性短肽标签的牛凝乳酶基因cym-5K、cym-5D、cym-5N,并构建表达载体p SZHG6R-cym、p SZHG6R-cym-5K、p SZHG6R-cym-5D、p SZHG6R-cym-5N,以Pgla A6R强启动子和Sgla A信号肽调控基因表达。通过农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导法将牛凝乳酶基因表达框整合到黑曲霉TH2的高表达的糖化酶gla A基因位点,成功筛选出4株纯合黑曲霉重组菌株TH2（gla A::cym）、TH2（gla A::cym-5K）、TH2（gla A::cym-5D）、TH2（gla A::cym-5N）。将这4株纯合黑曲霉重组菌株进行摇瓶发酵,取4-11天发酵液。通过酶活检测发现,TH2（gla A::cym）的发酵液上清并未表现出凝乳酶活性,而TH2（gla A::cym-5K）、TH2（gla A::cym-5D）、TH2（gla A::cym-5N）的发酵液上清酶活随发酵天数的增长而上升,直至第11天达到顶峰,分别为55.40±3.6 SU/m L、36.24±3.1 SU/m L、48.55±3.4 SU/m L。结果显示,极性短肽标签显著地提高了牛凝乳酶的分泌表达量。为提高重组牛凝乳酶在黑曲霉中的表达,对重组菌株TH2（gla A::cym-5K）的发酵条件进行了优化。结果表明,CPPs可以有效提升重组牛凝乳酶的分泌表达量,其添加量为1.5%时,酶活提高了176%。甘氨酸和脯氨酸的浓度为0.1 M时,可将重组蛋白活性提高了79%和60%。
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“碳中和”是地球对人们提出的新挑战。自工业革命以来人类对于碳资源的排放呈现出几何式的增长,在碳排放日益增长的今天,随之带来的环境问题愈演愈烈,空气平均温度逐年上升、各地发生不同程度的自然灾害等,如何能够在稳定发展经济的同时保护好生态环境,是当下需要认真思考的问题。地球大气中碳资源总量一直保持在一个相对稳定水平,大气中碳含量主要是由碳资源的排放量与碳资源的固定量来决定,陆地生态系统有着强大的储存碳资
沙漠化是当今世界面临的严重问题,它不仅侵蚀土地资源,而且造成难以估量的生态破坏与经济损失。近年来我国沙漠化治理取得了令人瞩目的成就,但其形势仍然严峻。历史沙漠变迁研究为我们了解现代沙漠奠定了基础,也是历史地理学的重要内容。历史时期中国干旱与半干旱地区经历了一系列沙漠化过程,但相关历史文献记录的局限性以及高分辨率资料的缺乏,致使气候变化主导说、人类活动主导说、气候与人类活动共同影响说在历史时期沙漠化
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