论文部分内容阅读
【目的】铝在环境中的广泛存在和在日常生活中的广泛应用使人们接触铝的机会大大增加。我国正常人摄铝主要来源于食品添加剂、含铝药物和铝制品等,铝暴露的问题比较严重且未引起足够重视。研究表明,铝过多进入体内会对人体健康造成危害。铝是一种慢性蓄积性神经毒素,铝在Alzheimer型老年性痴呆(AD)、透析性痴呆(Dialysis Encephalopathy,DE)等疾病中发挥的毒作用也已得到许多学者的肯定。流行病学调查结果表明,某些神经退行性疾病的发生与机体接触铝的量有关,发病率随机体接触铝量的增加而增加。目前已证明,铝是DE肯定的、唯一的致病因子。职业暴露的铝作业工人出现明显的神经功能性改变。目前临床上对于铝负荷过多引起的疾病倾向于使用铝螯合剂。国外学者主要使用去铁胺(DFO),发现排铝效果显著。但是DFO为天然微生物生长素,不能合成;不仅成本高,且口服无效,只能经肌肉或静脉注射给药;此外,DFO具有耳毒性、视觉障碍和生殖毒性等毒副作用。因而寻求一种价格低、口服有效、毒副作用小的排铝螯合剂具有重要的临床意义。1,2-二甲基-3-羟基-4-P比啶酮(deferiprone,DFP)做为一种Fe3+螯合剂用于排铁。本课题利用Fe3+与Al3+均为三价金属离子,且半径相似的特点,把DFP作为一种新型铝螯合剂进行研究。通过研究拟达到以下目的;1.建立一种新的合成DFP的方法;2.完成DFP的一般毒理学实验;3.对DFP的排铝效果从多方面进行研究;4.探讨DFP对慢性荷铝动物的保护作用机制。为寻求一种价格低廉、安全有效的治疗铝中毒的药物提供理论依据。【方法】1.DFP的合成2-甲基-3-羟基-4-吡喃酮与甲胺水溶液于95~100℃加热回流,得到白色结晶即DFP。2.DFP的毒理学实验2.1 LD50实验取健康昆明种小鼠50只,雌雄各半,按体重随机分为5个剂量组。以灌胃方式给药1次,观察1周(w),记录动物死亡数。2.2外周血和骨髓微核实验取健康昆明种小鼠60只,雌雄各半,按体重随机分为5组;阴性对照组、环磷酰胺阳性对照组、1/8LD50组、1/4LD50组、1/2LD50组,分别于第二次与第七次给药后24h进行DFP的微核实验。2.3精于畸变实验健康昆明种雄性小鼠150只,按体重随机分为5组;阴性对照组、环磷酰胺阳性对照组、1/8LD50组、1/4LD50组、1/2LD50组,给药5天(d),分别在给药后第14、28、35、42和70d进行DFP的精子畸变实验。3.DFP的排铝作用研究3.1小鼠的排铝实验健康昆明种小鼠84只,雌雄各半,22~24g,自由饮水和进食。随机分为6组;阴性对照组、荷铝对照组、预防组、低剂量组、中剂量组、高剂量组,以灌胃方式给药.将小鼠以颈椎脱臼法处死,取其血清、肝、肾、脑和骨骼组织。用原子吸收分光光度法测定小鼠血清和各组织中的铝、铜、锌、钙、铁、镁含量。3.2家兔排铝实验3.2.1急性排铝实验雄性新西兰大白兔24只,荷铝后随机分成荷铝对照组、低、中、高剂量组。将DFP的灭菌水溶液给低、中、高剂量组灌胃。收集尿液,待做元素铝及其他必需元素的测定。3.2.2与维生素C(Vc)、美司那(Mesan)协同排铝作用将24只新西兰大白兔随机分为荷铝组、DFP组、DFP+Vc组、DFP+美司那组。荷铝后依次灌胃给予灭菌无离子水、DFP、DFP+Vc、DFP+美司那。收集尿液,待做元素铝的测定。3.2.3不同给药方式的排铝作用比较18只新西兰大白兔随机分为荷铝对照组、灌胃组和注射组,荷铝后分别以灌胃和皮下注射方式给DFP。收集尿液,待做元素铝的测定。3.2.4亚慢性排铝实验新西兰大白兔16只,随机分为阴性对照组、荷铝对照组、DFP组。荷铝后DFP组用DFP溶液灌胃2周。分别于实验开始、染铝结束及给DFP结束时从兔耳静脉取血。第三次取血后,将兔处死,取肝、肾、脑、骨组织,待做血清及组织中铝及其他必需元素的测定。4.DFP对荷铝动物的保护作用机制研究4.1对荷铝小鼠抗氧化系统的恢复作用健康昆明种小鼠84只,雌雄各半,22~24g,自由饮水和进食。随机分为6组;阴性对照组、荷铝对照组、预防组、低、中、高剂量组,以灌胃方式给药。实验结束时,小鼠眼球取血及肝、肾、脑组织测定超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力和丙二醛(MDA)含量。4.2 DFP对慢性荷铝小鼠神经系统的保护作用健康昆明种小鼠98只,雌雄各半,22~24g,自由饮水和进食。按体重随机分为7组,以灌胃方式给药,分组情况如下;阴性对照组、预防组、低剂量组、中剂量组、高剂量组、荷铝组、盐酸吡硫醇对照组。4.2.1对荷铝小鼠学习记忆能力的影响实验结束前两天用跳台仪对小鼠进行跳台训练,24h后进行测试,记录小鼠跳台潜伏期和5min内的错误次数。4.2.2对中枢神经递质的恢复作用取各组小鼠测血清及脑组织匀浆中乙酰胆碱酯酶(AchE)活力。4.2.3对铝致海马损伤恢复的形态学观察小鼠海马苏木素-伊红染色(HE)染色,进行病理学观察,分析小鼠海马的形态学改变。4.2.4对荷铝小鼠细胞凋亡的保护作用给药结束后,小鼠心脏灌注进行固定,取海马组织,用免疫组织化学进行原位检测海马区Bax和Bcl-2蛋白的表达,检测DFP对铝致细胞凋亡的保护作用。4.3 DFP对铝诱发小鼠遗传物质损伤的抑制作用采用昆明种小鼠进行骨髓细胞微核实验和精子畸变实验。两种实验均随机分为5个剂量组;阴性对照组、阳性对照组、荷铝对照组、低剂量组和高剂量组。4.4 DFP对荷铝动物肝肾功能的影响Wistar大鼠AlCl3染毒3周后分别给予不同剂量的DFP 1周,测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)的活力及总蛋白、白蛋白、总胆红素和结合胆红素、肌酐、尿素氮、尿酸的含量。同时测定肝、肾组织中铝、锌、铜、铁、钙、镁等元素的含量。【结果】1.DFP的合成结果表明;熔点、红外与核磁波谱符合目标化合物的结构特征。收率为58.9%。2.DFP的毒理学实验2.1 DFP的LD50实验DFP的LD50为562.67mg/kg,其95%的可信限为501.19~630.96mg/kg。2.2外周血和骨髓微核实验外周血和骨髓PCE微核率1/8LD50、1/4LD50组微核率与阴性对照组相比均无显著性差异(P>0.05);1/2LD50组微核率高于阴性对照组(P<0.05)。2.3精子畸变实验1/8LD50、1/4LD50组与阴性对照组比较在第14、28、35、42、70d观察均无显著性差异;1/2LD50组与阴性对照组比较在第14、28、35d观察均有显著性差异(P<0.05),而在第42、70d观察均无显著性差异。3.DFP的排铝作用研究3.1小鼠的排铝实验结果3.1.1排铝作用脑、骨骼和肾脏铝中,预防组、低、中、高剂量组铝含量均低于荷铝组(P<0.05)。肝脏铝含量比较荷铝组高于其它各组,但无统计学意义。血清铝比较,预防组、低、中、高剂量组均低于荷铝组(P<0.05),但高于阴性对照组(P<0.05),低、中、高剂量组之间存在剂量反应关系。3.1.2对其它必需元素的影响脑、肝脏、肾脏和骨骼中的镁含量各组之间均无统计学意义。肾、肝、骨组织各组钙含量无统计学意义。脑和肝脏中的锌含量各组之间均无统计学意义。脑、肾脏和骨骼各组之间的铁含量相比,均无统计学意义。脑、骨骼和肝脏铜含量比较各组无统计学意义。3.2家兔排铝实验结果3.2.1急性排铝作用低、中、高剂量组在给DFP后每小时的排铝量较前1小时均有显著性增加(P<0.01),其排铝高峰在2~4小时范围内。6小时总排铝量低、中、高剂量组与对照组相比均有显著性增加(P<0.01)。3.2.2与Vc、美司那(Mesan)协同排铝作用DFP组、DFP+Vc组和DFP+美司那组均显示了明显的排铝效果,但3组的排铝曲线不同,后二组曲线峰值前移,提示铝代谢受到了DFP与Vc、美司那的共同作用。3.2.3不同给药方式的排铝作用比较6小时排铝总量注射组与灌胃组比较有显著性增加(P<0.05),排铝高峰灌胃组位于给药后第3h,注射组位于第2h。3.2.4亚慢性排铝作用给DFP后DFP组血清铝浓度显著低于给DFP前,亦显著低于荷铝组(P<0.05)。骨、脑、肝和肾组织中的铝含量DFP组均低于荷铝组(P<0.05)。3.2.5对必需元素铜、锌、锰排出的影响3.2.5.1急性排铝给DFP前后每小时铜、锌、锰在尿中排出均无显著性差异。给DFP 6小时后铜、锌、锰在尿中排出的总量各组之间亦无显著性差异。3.2.5.2亚慢性排铝脑、肝、肾、骨组织中铜、锌、锰的含量荷铝组和给DFP组差异均无显著性,即DFP对微量元素铜、锌、锰的动员及排出不产生影响。4.DFP对荷铝动物的保护作用机制研究4.1对荷铝小鼠抗氧化系统的恢复作用肝脏、脑、血清SOD活力、GSH-PX活力、MDA含量阴性对照组与荷铝组比较均有显著性差异(p<0.05);用药各组SOD活力、GSH-PX活力、MDA含量与阴性对照组比较肝、肾、脑、血清均无显著性差异。4.2 DFP对慢性荷铝小鼠神经系统的保护作用4.2.1对荷铝小鼠学习记忆能力的影响小鼠跳台实验表明;与荷铝组相比,预防组、低、中、高剂量组潜伏期显著降低(P<0.01,P<0.05),且各剂量组之间存在剂量效应关系;各剂量组与对照组相比均无统计学意义。荷铝组小鼠的错误次数显著高于阴性对照组(P<0.01),其它各组与阴性对照组相比无统计学意义(P>0.05)。4.2.2对中枢神经递质的恢复作用AchE活力荷铝组高于阴性对照组(P<0.05),中、高剂量组和预防组与荷铝组比较有显著性差异(P<0.05),与阴性对照组比较均无显著性差异。4.2.3对铝致海马损伤恢复的形态学观察对组织切片光镜下进行观察,荷铝组海马有明显损伤,用药各组损伤的组织均有一定程度的恢复。4.2.4对荷铝小鼠细胞凋亡的保护作用低剂量组、盐酸吡硫醇对照组Bcl-2蛋白表达与荷铝组比较无统计学意义,中、高剂量组和预防组均高于荷铝组(P<0.05);预防组、低、中、高剂量组均高于盐酸吡硫醇对照组(P<0.05)。荷铝组、预防组、低剂量组Bax蛋白表达均高于阴性对照组和盐酸吡硫醇对照组(P<0.05),中、高剂量组、盐酸吡硫醇对照组与阴性对照组比较无统计学意义;高剂量组低于盐酸吡硫醇对照组(P<0.05)。4.3 DFP对铝诱发小鼠遗传物质损伤的抑制作用DFP低、高剂量组的微核率均低于荷铝组(P<0.01);低、高剂量组比较有显著性差异(P<0.01),微核率随DFP剂量增加而降低。低、高剂量组精子畸变率显著低于荷铝组(P<0.05),但仍高于阴性对照组(P<0.05)。低、高剂量组之间比较亦有显著性差异(P<0.05),呈现剂量-效应关系。4.4 DFP对荷铝动物肝肾功能的影响4.4.1对肝功能的影响各组大鼠的ALT活力比较差异均无统计学意义;低、中、高剂量组的AST活力显著低于荷铝组(P<0.01);低剂量组ALP活力与荷铝组相比差异有统计学意义(P<0.01);荷铝组大鼠血清中总蛋白含量显著低于阴性对照组(P<0.01),预防组、中、高剂量组则显著高于荷铝组(P<0.01),且与阴性对照组相比无统计学意义;各组大鼠血清中白蛋白含量比较均无统计学意义;与阴性对照组相比,各组大鼠血清中总胆红素含量均显著增加(P<0.05,P<0.01),而结合胆红素含量比较均无显著性差异。Al含量测定结果显示;低、中、高剂量组均显著低于荷铝组(P<0.01),且含量呈下降趋势;给药各组的大鼠肝脏中锌、铜、铁、钙、镁的含量与阴性对照组相比差异均无统计学意义(P>0.05)。4.4.2对肾功能的影响荷铝组尿素氮含量显著高于阴性对照组(P<0.05),DFP各组与阴性对照组相比均无统计学意义;各组大鼠血清中肌酐、尿酸含量比较差异均无统计学意义。荷铝组肾脏中Al含量显著高于阴性对照组(P<0.01),DFP各组均显著低于荷铝组(P<0.01);荷铝组、低剂量组大鼠肾脏中铜含量均显著低于阴性对照组(P<0.01,P<0.05),而中、高剂量组与阴性对照组相比差异无统计学意义;低、中、高剂量组的大鼠肾脏中锌、铁、钙、镁的含量与阴性对照组相比差异均无统计学意义。【结论】1.DFP一般合成分三步进行,步骤多,时间长,反应条件要求苛刻。本研究建立的一步合成法,缩短了时间,降低了成本,提高了收率。2.DFP毒性低、排铝效果显著,同时对其它必需元素锌、镁、钙、铜、锰均无促排作用。3.DFP能够改善荷铝小鼠的学习记忆能力。4.DFP能拮抗铝诱发的中枢神经递质功能减退。5.DFP对铝引起的凋亡相关蛋白改变有一定的调节作用。6.DFP对铝诱发小鼠遗传物质损伤具有抑制作用。7.DFP对荷铝动物肝、肾功能具有一定的保护作用。总之,本研究建立了DFP新的合成方法;对DFP的毒性进行了评价;首次系统、全面地对DFP的排铝效果以及对荷铝动物的保护作用机制进行了研究。为寻求一种价格低廉、安全有效的治疗铝中毒的药物提供了理论依据。