论文部分内容阅读
背景和目的：原发性开角型青光眼(primary open angle glaucoma, POAG)是眼睛疾病当中迟发性、进行性且不可逆的主要致盲眼病之一,目前其发病机制尚未完全清楚,但一般认为眼压升高是其中主要的危险因素。因此,降眼压一直是眼科治疗青光眼的主要手段。现今大多数降眼压药物疗效不理想,且有一定的副作用。一旦患上青光眼就需要长期用药,因此也存在高额费用及治疗的依从性不佳等问题。此外,就药物作用机理而言,除胆碱能激动剂(如匹罗卡品)外,其他降眼压药并未针对房水的主要排出通道即小梁通道起作用。因而,在目前降眼压治疗存在许多问题的情况下,基因治疗的引入有特殊的意义。本课题将TGF-β/Smad信号通路辅阻遏因子c-Ski基因导入大鼠前房,探讨c-Ski基因表达对大鼠眼压的影响、可能的机制和转基因表达的副作用。以上研究国内外尚无报道。该项课题可望阐明用c-Ski基因治疗青光眼的可行性,为广大青光眼患者的治疗带来新的希望!研究目的包括：1、构建c-Ski基因的慢病毒表达载体,在293TN细胞中合成和收获病毒；2、慢病毒转导小梁细胞,探讨c-Ski在细胞水平的表达及其可能的影响眼压机制；3、将病毒一次性导入大鼠前房,观察c-Ski的表达对眼压的影响及眼内毒性反应等,初步探讨c-Ski影响眼压的机制。方法：1.构建同时表达c-Ski和GFP基因的慢病毒载体(HIV-c-Ski/GFP),并证实在细胞水平上表达目的蛋白；仅表达GFP基因的慢病毒载体(HIV-GFP)作为对照,下同。包装成具有感染(转导)能力的病毒颗粒。2. HIV-c-Ski/GFP转导培养的人眼小梁细胞(trabecular meshwork cells,TMCs);观察转基因表达的时间及其对细胞形态、细胞外基质、肌动蛋白细胞骨架及其细胞连接的影响。3.采用SD大鼠做实验。HIV-c-Ski/GFP转导大鼠眼,与对照相比,检测转基因表达对眼压的影响,转基因产物在小梁通道表达及其对小梁大体形态的影响,并观察可能存在的副作用如炎症反应等。结果：1、成功构建pCDF 1-MCS2-EF1-copGFP-C-Ski表达载体,经酶切和测序鉴定,仅有一处碱基改变,即第1476位的C突变为T,但不影响所编码的氨基酸,其他序列完全相同。经293TN细胞包装后收获了病毒HIV-c-Ski和HIV-GFP,病毒滴度均为3.4×108 TU/ml。2、Western-blot结果显示：Ski在HIV-c-Ski、HIV-GFP感染小梁细胞及未处理小梁细胞中均有表达。HIV-c-Ski感染的小梁细胞Ski表达增强,证实转导成功。免疫荧光结果显示,和HIV-GFP组和空白细胞组相比,HIV-c-Ski人小梁细胞肌动蛋白骨架降解,β-catenin蛋白表达减弱。3、治疗组和对照组的基线眼压(10：00-11：00)分别为13.02±0.48mmHg和13.05±0.52mmHg,差别无统计学意义(P>0.05,n=12)。病毒注射后第11天,治疗组眼压开始下降,与对照组相比,差别有统计学意义(P<0.05)；第13天开始,治疗组眼压与基线眼压及对照组眼压相比,差别均有统计学意义(P<0.05)；之后治疗组眼压持续下降,稳定在一个相对低水平,直至第21天处死。纳入的12只大鼠未见明显的角膜、前房炎症反应及其它眼部异常。4、免疫细胞化学结果显示：大鼠前房注射病毒后4周,实验组小梁网细胞外基质(extracellular matrix, ECM)和细胞肌动蛋白骨架蛋白均表达减弱。结论：1、成功构建pCDF 1-MCS2-EF1-copGFP-c-Ski慢病毒表达载体,在293TN细胞中包装得到具有感染能力的病毒颗粒。2、病毒转导小梁细胞,在小梁细胞中表达c-Ski,并经免疫细胞化学和Western-blot证实,c-Ski基因可引起人小梁细胞肌动蛋白骨架的降解及细胞连接蛋白β-catenin表达减少。3、慢病毒介导的c-Ski在大鼠小梁网ECM蛋白的表达及肌动蛋白和相关连接蛋白的表达减弱。4、HIV-c-Ski前房内注射能降低大鼠眼压,治疗效果优于HIV-GFP组。其降眼压机制可能是通过小梁通道表达c-Ski基因抑制TGF-β/Smad信号通路,降解肌动蛋白和ECM来实现。