单一识别荧光探针只能识别一种分析物,无法用于研究多个活性物质之间的关联和协同作用机制。使用两个或多个单一识别的荧光探针进行多功能检测时有明显缺陷,例如:多个荧光探针同时用于监测时存在潜在串扰,由于它们的亚细胞器定位或光漂白速率不同会导致成像情况复杂。多功能荧光探针可以识别多个活性物质,在识别过程中伴随有荧光变化和溶液颜色变化,应用于细胞成像时一般能观察到多个通道的荧光响应。由于上述优点,近些年多功能荧光探针受到人们广泛关注,它们被用于一些结构相似的活性物质的同时识别、不同活性物质间的相互作用的可视化监测以及不同活性物质的作用机制研究。基于此,本论文发展了三个氧化还原响应类型的多功能荧光探针（探针NPCC、探针NPCF和探针NPCl A）和两个非氧化还原响应类型的多功能荧光探针（探针NPHSHNO和探针NPCysHS）,具体内容如下:（1）设计合成了首例用于连续检测Cys、GSH和ClO^-的靶向内质网的双光子荧光探针NPCC。光谱性能研究表明,该探针选择性好、灵敏度高、毒性低,可动力学区分Cys和GSH。细胞成像研究表明,探针NPCC可用于细胞内ClO^-的双光子成像,可定位到内质网,可用来监测内质网中的还原应激。此外,探针还可以区分癌细胞和正常细胞。该探针可用作研究RSS和ROS之间关系时的一种简单有效的工具。（2）设计合成了一种双位点响应的近红外荧光探针NPCF,该探针可在100%缓冲液中以“裸眼识别”的方式实现对二氧化硫衍生物和pH值的双识别。探针NPCF对HSO₃^-的检测具有很高的灵敏度（LOD为22.7 nM）和良好的选择性。当探针NPCF溶液的pH从9.21变为4.26时,可观察到610 nm处的荧光增强了885倍。NPCF成功应用于斑马鱼中HSO₃^-的检测,这表明探针NPCF在生物学中具有潜在应用价值。通过探针NPCF的细胞成像应用研究,我们发现SO₂可用于缓解由LPS引起的炎症和酸化环境。在CCCP诱导的细胞损伤和凋亡的不同阶段,细胞内SO₂的水平和pH值变化不同。在损伤和凋亡的初始阶段,SO₂的量会逐步增加,而pH会逐渐降低;在严重损伤阶段,SO₂的量会逐渐减少,而pH逐渐升高。本研究为了解细胞损伤机制提供了一种新思路和简单有效的工具。此外,通过应用NPCF监测细胞内SO₂的水平和pH值变化可区分正常细胞和癌细胞,该探针有望成为癌症早期诊断的一种简便和实用的工具。（3）设计合成了一种双位点响应、三通道成像和靶向线粒体的双光子荧光探针NPCl A。该探针可以同时检测HSO₃^-和ClO^-,并且具有“裸眼识别”、选择性好和灵敏度高的优点。运用该探针监测细胞内HSO₃^-和ClO^-的水平可区分正常细胞和癌细胞,这表明探针NPClA在癌症的早期诊断方面具有潜在的应用价值。过量HSO₃^-和LPS诱导的线粒体应激实验表明,线粒体中SO₂和ClO^-处于动态平衡。此外,我们还进行了过量ClO^-诱导的氧化应激的原位细胞成像实验,结果表明细胞应激产生了内源性的SO₂,即应激产生抗氧化。该探针进一步解释了线粒体中SO₂的氧化/抗氧化双重作用。该探针为监测线粒体应激过程中ROS/RSS的平衡和了解线粒体中SO₂的氧化/抗氧化双重作用提供一种有用的检测工具。（4）设计合成了首例同时识别HS^-和HNO的多功能荧光探针NPHSHNO,该探针由一个荧光团和两个识别位点组成,在识别过程中发生了PET机理和ICT机理。探针用于检测时伴随有明显的溶液颜色变化和荧光强度变化,探针对HS^-和HNO的识别选择性好,检测限分别为1.02μM和0.67μM。探针的两个识别位点分别识别HS^-和HNO,可以作为分子逻辑门的两个输入信号,只有同时存在HS^-和HNO时,即发生“AND”型逻辑门信号释放,探针荧光才完全释放。探针NPHSHNO成功应用于细胞内H₂S和HNO的检测。（5）设计合成了一种同时识别Cys和HS^-的多功能荧光探针NPCysHS,该探针由一个荧光团和两个识别位点组成,“NBD-N-”作为特异性识别HS^-的识别位点,可以在红色通道区分Cys和HS^-,“NBD-O-”的引入,使得探针NPCysHS可以在绿色通道区分Cys和HS^-。探针在识别过程中发生了PET机理和ICT机理,并且在用于检测时伴随有明显的溶液颜色变化和荧光强度变化。探针对Cys和HS^-的识别选择性好,检测限分别为0.15μM和37.7 nM。探针NPCysHS成功应用于细胞内Cys和HS^-的检测。