介导胚胎发育的相关信号通路在成体组织中的异常再活化与肿瘤发生之间的密切关系日益引起人们关注,Sonic hedgehog (SHH)信号通路即为其中一种。SHH信号通路主要由配体SHH,跨膜受体Patched (PTCH),信号转导子Smoothed(SMO)以及下游转录因子Glioma-associated oncogene homolog(Gli)组成,该信号参与胚胎发育过程中的多个阶段,包括肺组织发育。随着SHH信号的活化,下游Gli家族分子稳定性增强并移位至核内,继而介导一系列参与旁路反馈调节,促细胞增生、分化,抗细胞凋亡,维持干细胞数量以及促进上皮间质转化等靶基因的转录,由此构成调控正常胚胎发育的基础。自1996年人们首次发现该信号在成体组织中的异常活化与人类肿瘤一基底细胞癌之间的内在联系后,围绕该信号的异常活化与肿瘤发生的相关研究大量展开。现有研究显示在人类多种组织来源的肿瘤组织中存在该信号以不同活化机制产生的异常活化,并在促进肿瘤发生发展中发挥关键作用。由于该信号通路在正常成体中的相对静息状态,于是人们期待阻断该信号在肿瘤中的异常活化能成为相关肿瘤治疗中有效且低副作用的新靶点。在向这一目标迈进过程中,除了更详尽地阐明该信号通路传导过程中的精确调控机制外,在特定肿瘤中进一步澄明该信号确切的再活化状态以及其致癌机制亟待解决。有关该信号在肺癌中的异常活化,在2003年由Watkins等在对肺小细胞癌的研究中被首次报道,而在非小细胞肺癌(non-small cell lung carcinomas,NSCLC)中关于SHH信号的活化情况目前报道颇少且存在争议,而该信号与NSCLC发生发展的关系和异常活化机制更不甚明了。究竟SHH信号异常活化在NSCLC中如何存在?是否扮演重要角色?阻断该信号能否成为NSCLC治疗的新靶点?针对这些问题,我们着手以下研究工作,分三部分进行。第一部分配体依赖的SHH信-号-在人非小细胞肺癌中的异常活化目的：明确人NSCLC组织中SHH信号异常活化情况,并探讨其在NSCLC发生发展中的意义。方法：免疫组化法检测87例NSCLC组织,12例肺腺癌癌旁不典型腺瘤样增生(atypical adenomatous hyperplasia, AAH)组织以及20例癌旁正常肺组织中SHH信号通路分子SHH, GLI1, HHIP表达,并评价分子间相互关系及其与临床病理参数之间的关系。结果：与癌旁正常肺组织相比,SHH, Gli1, HHIP表达上调分别在87/87(100%),74/87(85.1%),75/87(86.2%)的NSCLC组织中检见。在所有NSCLC组织中,SHH表达与Gli1表达之间呈现显著正相关关系(rs=0.592,P=0.000),而两者与HHIP间皆未检见相关性。大多数NSCLC组织中呈现配体依赖的SHH信号异常活化,但在肺腺癌组织多数呈SHH信号高度活化,其高度活化率显著高于鳞癌和大细胞(P<0.05)。在肺腺癌中SHH信号活化程度与癌组织分化程度呈显著正相关(P<0.05),且不同的组织学亚型亦呈现不同程度的信号活化,浸润型腺癌中的微乳头生长为主型和实性生长为主型其SHH信号高度活化率显著低于其它腺癌亚型(P<0.05)。高水平的SHH信号活化除了在多数早期腺癌一原位腺癌(adenocarcinoma in situ, AIS)和微小浸润癌(minimally invasive adenocarcinomas, MIA)被检见外,12例肺腺癌癌前病变一不典型腺瘤样增生(atypical adenomatous hyperplasia, AAH)组织中10例(83.3%)亦呈现SHH信号高度活化。结论：NSCLC中存在配体依赖的SHH信号广泛异常活化。该信号异常活化与肺腺癌发生关系更为密切,且可能是肺腺癌发展过程中的早期分子事件。第二部分SHH表达上调对人肺腺癌细胞体内外生物学效应的影响目的：了解SHH表达上调对人肺腺癌细胞体内外生物学行为的改变以及其中可能的机制。方法：体外培养人肺腺癌A549和H1975细胞,将细胞随机分为未感染组、对照空载慢病毒感染组和重组SHH过表达慢病毒感染组。应用CCK-8法,流式细胞周期分析和凋亡检测,平板克隆形成实验和Transwell小室实验分别观察各组细胞体外增殖、凋亡以及迁移能力的改变。并通过裸鼠成瘤实验比较SHH过表达病毒感染组和空载病毒感染组细胞裸鼠皮下接种成瘤能力的差异。同时,用RT-qPCR和Western Blot法分别检测Gli1和相关通路靶基因cyclinD1,Bcl2和FOXC2的表达。结果：SHH过表达病毒感染组细胞较未感染组和对照病毒感染组其增殖、迁移能力显著增强且凋亡水平降低(P均<0.05),而未感染组和对照病毒感染组未见显著差异(P>0.05)。与对照病毒感染组细胞相比,SHH过表达病毒感染组细胞皮下瘤结节生长速度快,最终成瘤体积和重量皆显著大于对照感染组(P均<0.05)；此外,Glil,cyclinD1,Bcl2和FOXC2的表达在SHH过表达病毒感染组细胞皆较相应两对照组显著上调(P均<0.05)。结论：SHH表达上调可促进肺腺癌细胞增殖和迁移,并抑制细胞凋亡,其分子机制可能与SHH信号高度活化上调下游靶基因cyclinD1,FOXC2和Bc12的表达有关。第三部分敲减SHH对人肺腺癌细胞体内外生物学效应的影响目的：观察SHH敲减的肺腺癌细胞体内外生物学行为的改变,并进一步探讨其中可能的机制,以了解SHH敲减在干预肺腺癌发生发展中的意义。方法：应用慢病毒工具载体构建SHH-shRNA重组慢病毒载体以及对照慢病毒载体。体外培养人肺腺癌A549和H1975细胞,将细胞随机分为未感染组、对照慢病毒感染组和SHH-shRNA重组慢病毒感染组。应用CCK-8法,流式细胞周期分析和凋亡检测,平板克隆形成实验和Transwell小室实验分别观察各组细胞体外增殖、凋亡以及迁移能力的改变。并通过裸鼠成瘤实验比较SHH-shRNA重组慢病毒感染组和对照病毒感染组细胞裸鼠皮下接种成瘤能力的差异。同时,用RT-qPCR和Western Blot法分别检测Gli1和相关通路靶基因cyclinD1,Bcl2和FOXC2的表达。结果：成功构建三种SHH-shRNA重组慢病毒载体并筛选到其中干扰效率最高者用于实验。SHH-shRNA重组慢病毒感染组细胞较未感染组和对照病毒感染组其增殖,迁移能力显著降低且凋亡水平增高(P均<0.05),而未感染组和对照病毒感染组未见显著差异(P>0.05)。与对照病毒感染组细胞相比,SHH-shRNA病毒感染组细胞皮下瘤结节生长速度,最终成瘤体积和重量皆显著降低(P均<0.05)；此外,Gli1, cyclinD1, Bcl2和FOXC2的表达在SHH-shRNA病毒感染组细胞皆较相应两对照组显著降低(P均<0.05)。结论：敲减SHH表达可抑制肺腺癌细胞增殖和迁移,并促进细胞凋亡,其机制与其下调配体依赖的SHH信号活化水平从而抑制下游靶基因cyclinD1, FOXC2和Bc12的表达有关。总结：结合前面三部分体内外实验结果,可以证实：(1)肺腺癌中配体依赖的SHH信号呈现广泛异常活化；(2)该信号在肺腺癌中的异常活化具有促进癌细胞增殖和迁移并抑制其凋亡的多重作用,其作用机制与上调信号下游多个相关靶基因表达有关；SHH信号的多重作用提示其可能参与肺腺癌发生发展中的多个阶段；(3)抑制SHH表达,阻断该信号通路有望成为肺腺癌治疗的有效途径。