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目的:检测抗氧化剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)单用及联合顺铂体外对人宫颈癌SiHa细胞增殖、凋亡及对SiHa细胞核内核转录因子-κB(nuclearfactor-kappaB,NF-κB)活性的影响,探讨PDTC体外抗宫颈癌作用的价值和机制,进一步探讨在宫颈癌NF-κB信号转导通路与顺铂耐药性的关系。
方法:
1.通过体外培养宫颈癌SiHa细胞,采用WST-8方法检测不同浓度PDTC、DDP及两者联合应用对SiHa细胞生长抑制率的影响。
2.Hoechst33258染色检测PDTC和DDP作用后SiHa细胞的凋亡形态学改变。
3.采用流式细胞仪和AnnexinV-FITC细胞凋亡试剂盒检测不同浓度PDTC、DDP及两者联合应用对SiHa细胞早期凋亡率、晚期凋亡和坏死率的影响。
4.提取核蛋白进行凝胶迁移变动分析(electrophoreticmobilityshiftassay,EMSA)检测SiHa细胞内NF-κB的组成性激活及不同浓度PDTC在不同时间对组成性激活的抑制;同时检测TNF(50ng/ml)刺激30min和不同浓度DDP刺激45min后对SiHa细胞内NF-κB活性的诱导性激活及不同浓度PDTC对诱导性激活的抑制。
结果:
1.PDTC能有效抑制人宫颈癌细胞株SiHa的生长,并且具有浓度依赖性,浓度为50PM以上具有时间依赖性(P<0.01);顺铂可以抑制SiHa细胞增殖,并呈浓度与时间依赖性,在24h,在0.01-1.0μg/ml低浓度时对SiHa细胞的抑制作用不明显;在1.0-20μg/ml之间随顺铂浓度的升高,抑制作用逐渐加强,但均未达到IC50;在48h,在0.01-0.1μg/ml低浓度时对SiHa细胞的抑制作用不明显,在0.1-10μg/ml之间随浓度的升高,抑制作用逐渐加强,大于10μg//ml后,随浓度升高抑制作用增加不明显(P>0.05)。联合用药显示,PDTC联合应用顺铂能显著提高顺铂的细胞毒性,并具有协同效应。
2.PDTC50μM和DDP5μg/ml作用SiHa细胞24h后Hoechst33258荧光染色可见凋亡细胞。
3.PDTC诱导SiHa细胞早期凋亡、晚期凋亡和坏死的发生,早期凋亡率在一定程度上呈浓度依赖性;PDTC100M组晚期凋亡和坏死率与其他组比较明显升高(P<0.01);顺铂诱导SiHa细胞早期凋亡、晚期凋亡和坏死的发生,并在一定程度上呈浓度依赖性;PDTC联合顺铂可以使SiHa细胞早期凋亡率、晚期凋亡和坏死率均有明显升高,显示具有协同效应。
4.宫颈癌细胞株SiHa核内存在NF-κB的组成性激活,PDTC可以抑制组成性激活(constitutiveNF-kappaBactivity),在4h时抑制作用最强,且呈浓度依赖性,其抑制强度与24h细胞生长抑制率呈直线正相关(r=0.931,P=0.035),与PDTC作用48h致早期凋亡率呈曲线正相关(r=1.000,P=0.011);TNF和DDP诱导SiHa细胞核内NF-κB活性的增加,用PDTC预处理可抑制TNF和DDP的诱导性激活,PDTC预处理组与未经PDTC预处理组比较NF-κB活性明显下降(P<0.01)。
结论:
1.PDTC可抑制SiHa细胞的增殖,诱导细胞凋亡和抑制SiHa细胞NF-κB的组成性激活;PDTC对SiHa细胞的致凋亡作用可能与其抑制NF-κB信号转导通路,启动凋亡程序有关。
2.DDP能抑制SiHa细胞增殖,促进细胞凋亡,但SiHa细胞对顺钔存在一定的耐药;同时DDP能诱导NF-κB的激活;PDTC增加SiHa细胞对DDP的敏感性,其机制可能与PDTC抑制DDP引起NF-κB的诱导性激活,进而影响NF-κB信号转导通路有关。
3.抗氧化剂PDTC既可以抑制SiHa细胞NF-κB的组成性激活,又可以抑制TNF和DDP引起的NF-κB诱导性激活,其可以作为NF-κB抑制剂用于宫颈癌研究。
4.抗氧化剂PDTC有望为宫颈癌化学防治带来新的前景。
5.NF-κB信号转导通路在宫颈癌对顺铂耐药中起一定作用,NF-κB抑制剂与顺铂联合可能成为宫颈癌治疗的新靶点。