植物的新陈代谢不仅需要光,还需要水和特定的矿质元素满足生长和发育的需求。铜和铁是植物生长发育必需的矿质营养元素,在植物体内多种生理代谢过程中都发挥着重要作用。目前已经发现有多种金属转运蛋白家族参与植物体内对铁以及铜的吸收转运过程,例如重金属ATP酶(HMA)蛋白家族以及黄色条纹转运蛋白(YSL)家族。铜和铁既能以离子的形式直接被转运蛋白进行转运,也可以和金属螯合物进行结合形成复合物被金属转运蛋白转运,常见的金属螯合物包括烟酰胺(NA)、植物螯合肽(PC)、脱氧麦根酸(DMA)、谷胱甘肽(GSH)等物质。目前对铜和铁在植物体内的吸收、运输和分配机制的研究逐渐深入,但是目前对于铜和铁的长距离运输机制还有许多细节仍有待解释。本课题发现拟南芥(Arabidopsis thaliana)内两个可能参与到离子转运的基因,并将其分别命名为NAT1和NAT2。NAT1和NAT2同属于NPF转运蛋白家族,对两者的氨基酸序列进行比对后发现NAT1和NAT2相似性高达74.1%。通过CRISPR-Cas9技术敲除NAT1和NAT2基因,制备筛选获得nat1、nat2、nat1nat2拟南芥突变体。在之后的培养过程中,观察发现nat1、nat2与野生型Col-0表型相似,但是nat1nat2双突变体在生长时期叶片变黄,株高显著降低,果荚短小且种子数量减少,表明两基因可能在功能上存在冗余性。通过ICP-MS(Inductively coupled plasma-mass spectrometry)技术分别测定Col-0、nat1、nat2、nat1nat2突变体中的离子含量,结果显示与野生型相比,nat1、nat2突变体叶片以及种子中的离子含量没有明显差异,但是nat1nat2双突变体叶片中铜的含量下降了约70%,钴的含量下降了约50%,而且种子中铜和铁的含量也分别下降了40%以及60%。nat1nat2叶片以及种子离子含量的变化表明,NAT1、NAT2可能参与了离子在拟南芥根部以及地上部的长距离运输过程。分别对野生型和nat1nat2突变体中的不同组织取样测定离子含量,检测结果显示,与Col-0相比,nat1nat2突变体根部铜和钴的含量显著升高,但在地上部包括茎、老叶、新叶、花、角果、种子中含量显著下降;而nat1nat2突变体地上部中新叶、花、角果、种子中铁的含量显著减少。以上结果表明NAT1以及NAT2可能参与了拟南芥体内铜、钴、铁的长距离运输过程。进一步使用X射线荧光光谱技术(XRF)分别检测Col-0、nat1、nat2、nat1nat2突变体的幼苗根部以及成熟种子中铁的含量,结果表明nat1nat2突变体种子与Col-0存在显著差异,这与上述ICP-MS结果相符合。构建NAT1以及NAT2基因过表达载体转化Col-0植株,将筛选获得的转基因阳性苗植株在含有过量铜和钴的培养基上生长。观察发现,与野生型相比,NAT1和NAT2过表达植株叶片变黄,在高浓度钴和铜胁迫下表现出了更高的敏感性。根据以上实验结果推测,NAT1以及NAT2共同参与了铜、钴由根部转运至地上部的转运过程以及铁在生殖生长期从叶中转移至花和种子中转运过程。亚细胞定位分析NAT1以及NAT2蛋白在细胞内呈现点状分布。除了上述离子表型外,nat1nat2还存在生殖缺陷。nat1nat2双突变体种子的萌发率也显著下降,只有3%左右。观察发现nat1nat2双突变体未成熟果荚中的种子颜色比较透明,成熟种子则颜色较浅、形态不饱满。而使用透明液对同一成熟期的Col-0、nat1、nat2、nat1nat2突变体透明化后,发现nat1nat2突变体胚胎发育停滞,不能完成正常的胚胎生长发育。但是,向土壤中外源施加铜和铁可以部分回补nat1nat2不育的表型,而这种不育的表型主要是由于缺铁造成的。因此推测,NAT1和NAT2通过调控拟南芥中铜和铁的转运进而影响到拟南芥正常的生长生殖发育过程。本研究为植物体内铜和铁的长距离运输提供了一个新的思路,为铜和铁调控拟南芥生殖生长发育提供了新的方向。