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背景和目的近些年,甲状腺癌的发病率呈现出逐年增高的趋势,约占人类所有恶性肿瘤的2%,且是内分泌系统中发病率最高的肿瘤,女性发病率显著高于男性。甲状腺癌根据病理分型可分为:甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌、未分化甲状腺癌和甲状腺髓样癌。其中甲状腺乳头状癌与甲状腺滤泡状癌统称为分化型甲状腺癌,甲状腺乳头状癌约占甲状腺癌病理分型中的95%。近些年研究及临床经验表明,大部分的分化型甲状腺癌经规范的治疗后预后较好,长期生存率高达90%左右。但分化型甲状腺癌仍然具有着相对较高的转移率、复发率的特点。随着精准医学的快速发展,甲状腺癌相关的分子学标志物被逐步发现。其中抑癌基因的失活和凋亡调控基因表达水平失衡是甲状腺癌发生、发展中两个重要的过程。最新的研究证实,卷曲螺旋结构域蛋白67基因在分子细胞学水平被初步证实为一个新的抑癌基因,且与BRAF基因突变、Bcl-2/Bax表达水平存在一定关联。因此,本实验首先用免疫组化法在临床手术切除的甲状腺癌及癌旁组织中检测了CCDC67蛋白、Bcl-2蛋白的表达情况,分析蛋白表达与临床病例特征的相关性。然后通过构建慢病毒介导的CCDC67过表达甲状腺乳头状癌细胞株,构建甲状腺乳头状癌裸鼠荷瘤模型,通过活体成像技术确认细胞株成瘤效果,处死裸鼠后分析瘤重、体积,计算抑瘤率。接着,我们将瘤体进行石蜡包埋,通过HE染色确定病理类型;通过免疫组化SP法检测鼠瘤组织切片中CCDC67蛋白、Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Caspase3蛋白、β-catenin蛋白、Cox2蛋白的表达情况,以初步探索过转染组与非转染组成瘤结果存在差异性的机制。最后,通过TUNEL法检测鼠瘤组织切片中细胞凋亡情况,并分析转染组与非转染组的凋亡指数。上述实验旨在探索CCDC67基因在裸鼠体内的生物学效应,并初步分析其在体内作用的分子机制。材料与方法1.收集57例临床手术切除的甲状腺癌及癌旁组织标本。通过免疫组化法检测CCDC67基因,Bcl-2基因在甲状腺癌患者癌组织切片中的表达情况,分析二者及临床病理特征的相关性。2.构建慢病毒介导CCDC67过表达TPC-1细胞株OE,空载体病毒构建细胞株NC。3.TPC-1细胞株接种3只BALB/c裸鼠,初步构建TPC-1裸鼠荷瘤模型,确认TPC-1细胞株裸鼠成瘤的可行性。转染细胞株OE、空载体细胞株NC、空白对照细胞株CON(TPC-1)接种3组各10只BALB/c雌性裸鼠,活体成像技术检测OE、NC鼠瘤体荧光峰值,观察至接种第20天处死裸鼠取瘤体称重,根据瘤体重量、体积分析计算抑瘤率及三组细胞株成瘤结果差异。4.裸鼠处死后摘除瘤体,RT-PCR及免疫组化法确认瘤体内CCDC67的表达情况。应用免疫组织化学SP法检测三个细胞株构建所得成瘤模型的瘤体中CCDC67、Bcl-2、Bax、caspase-3、cox-2及β-catenin蛋白的表达情况,并用Image J软件分析差异。5.采用SPSS 21.0统计学软件对上述实验数据进行统计学分析,单因素方差分析对多样本均属进行比较,用t检验分析两定量样本,用χ2检验进行两样本率的比较,以P<0.05为差异具有统计学意义。结果1.57例PTC组织中CCDC67蛋白表达率为43.86%(25/57),表达率为明显低于癌旁组织的表达率100%(57/57),差异具有统计学意义(P﹤0.05);BCL2-蛋白在癌组织表达率为57.89%(33/57),高于在正常组织中的表达率15.79%(9/57)(P﹤0.05)。CCDC67基因的低表达与Bcl-2的高表达呈正相关(r=0.400,P﹤0.05)。2.Annexin V/PI双染色流式细胞凋亡检测OE组细胞凋亡水平高于CON组和NC组(P﹤0.05)。3.甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1具有构建裸鼠荷瘤模型的生物学效应,选择该细胞株构建裸鼠荷瘤模型存在可行性。4.OE组瘤体平均重量明显低于CON组及NC组平均瘤体重量(P﹤0.05),CON组瘤体平均重量与NC组瘤体平均重量差异无统计学意义(P﹤0.05)。OE组荷瘤裸鼠活体成像荧光总量、单位面积荧光量均低于NC组(P﹤0.05)。5.OE组裸鼠瘤体组织中呈现出CCDC67mRNA高表达,而CON组和NC组裸鼠瘤体mRNA呈现出CCDC67mRNA表达缺失(P﹤0.05)。6.免疫组织化学及实时荧光定量PCR结果表明,CCDC67在全部OE组瘤体组织切片中呈现高表达,在NC组和CON组表达水平低于OE组(P﹤0.05);Bax蛋白在OE组瘤体组织切片中的表达水平高于CON组和NC组,而CON组与NC组之间表达水平差异无统计学意义(P﹤0.05);Bcl-2蛋白在OE组瘤体组织切片中的表达水平低于CON组和NC组,而CON组与NC组之间表达水平差异无统计学意义(P﹤0.05);β-catenin蛋白在OE组瘤体组织切片中表达异常率低于CON组和NC组,而CON组与NC组之间表达水平差异无统计学意义(P﹤0.05)。结论:在临床手患者经手术切除的甲状腺乳头状癌标本中CCD67基因的表达出现缺失,其表达缺失情况与对应患者的肿瘤大小、肿瘤TNM分期、临床病理分级存在相关;Bcl-2基因的表达出现缺失,其表达缺失情况与对应患者的肿瘤TNM分期、临床病理分级存在相关;且CCDC67与Bcl-2基因的表达存在关联。利用慢病毒介导的CCDC67基因转染TPC-1细胞株所构建的裸鼠荷瘤模型中,CCDC67高表达组的瘤体体积、重量、生长速度均受到抑制,且根据蛋白Bax/Bcl-2的检测、Caspase-3、wnt通路中β-catenin及Cox-2蛋白的检测结果,提示CCDC67可能参与了肿瘤的发生及凋亡机制的调控。结合前期的体外细胞学及分子学实验,完全可以证明CCDC67基因是一个新的抑癌基因。但CCDC67基因所涉及的具体信号转导通路分子学机制仍有待进一步研究。