目的心肌缺血再灌注损伤在临床上较为多见，如溶栓治疗、冠脉血管成形术、主动脉阻断、心肺转流后，它不仅引起局部损伤，而且可波及远处的非缺血器官，引起心律失常、心肌顿抑、心功能不全，甚至发展为致死性的多器官功能不全综合症（MODS）。这些现象在急性心肌梗死的血运重建时临床表现为再灌注后血压下降，术中并发无再流或慢血流现象（no-reflow or slow-flow phenomenon）现象，不能实现心肌水平的再灌注，术后再梗死、恶性心律失常和心力衰竭的发生率和死亡率明显增加，严重影响患者的预后。因此，如何减轻再灌注损伤，最大限度保护缺血心肌，已受到越来越广泛的关注。1986年Murry等报道缺血预处理（ischemic preconditioning IPC）现象，为心肌缺血再灌注的预防开拓了一个新的研究领域。其最初的定义是“一种短暂缺血后诱发的快速适应性反应，能减少在随后较长的缺血期中细胞的坏死”。目前人们逐渐认识到IPC是一种广泛存在的生物学现象，发现缺血预处理能有效的减小持续的缺血再灌注时的心肌损害，对心肌起到保护作用。动物实验和临床观察均已经证实预处理是有效的心脏保护手段。有研究证明肾动脉、肠系膜动脉及股动脉等远距非心脏缺血预处理对心肌亦有保护作用。随着这一现象发生机制的深入探讨，药物预处理的实验研究也广泛开展，并取得了令人鼓舞的结果，但是不论是缺血预处理还是药物预处理，干预的时间都是在心肌缺血前实施，而临床上病人发生缺血的时间无法预报，因此缺血预处理和药物预处理在临床应用中受到限制。但是，在临床上我们不可能通过对正常人实施预处理来减轻患冠心病时行PCI造成的心肌损害，而且由于人们的医疗意识淡薄，患者往往在出现严重心肌缺血甚至心肌梗死后才来就诊，因此寻找一种心肌缺血事件发生后的非创伤性的心肌保护方法，将具有十分重要的实用价值和临床意义。近几年国内外学者提出了缺血后处理的概念，并进行了相关的研究，发现具有和预处理相似的心脏保护作用，机制两者可能并不相同，缺血后处理具有更好的临床可操作性和应用前景。缺血后处理最早是由Zhao等提出，并进行了系列研究。在冠状动脉再灌注开始时对冠脉进行反复短暂的开通及再闭能够减轻缺血-再灌注损伤，对缺血再灌注心肌有显著保护作用，称之为缺血后处理（ischemic postconditioning）。实验结果表明：后处理可以减少梗死面积，保护内皮功能，减少缺血梗死区中性白细胞的聚集，从而发挥心脏保护作用，这一保护作用在程度上和缺血预处理相似，再灌注的最初几分钟实施这一内在的保护机制可以特异性的减轻缺血再灌注损伤。到目前为止，缺血后处理心脏保护措施已经在不同动物模型（包括犬、兔和鼠）及离体心脏得到证实，发现具有缺血后处理可产生和预处理相似的心脏保护作用，机制两者可能并不相同，缺血后处理具有更好的临床可操作性和应用前景。俄罗斯联邦医科大学Galagudza等进行的研究显示，缺血后处理可显著减少离体大鼠心脏灌注模型缺血后持续再灌注引起的室性心动过速，是保护心脏防止再灌注损伤的新方法。亦有报道非创伤性双下肢缺血后处理对心肌缺血再灌注损伤有保护作用。研究发现，对心外组织如肾脏、小肠及骨骼肌进行后处理不仅能减轻局部组织的再灌注损伤，对远隔的心脏也有保护作用，并将这种现象称为远隔后处理。虽然IPC现象己达成共识，但其确切机制，特别是IPC引发的细胞内信号转导机制尚不完全明了。人们进行了大量的研究，逐渐认识到IPC是心脏的一种自我保护机制，触发心脏在缺血早期释放某些内源性活性物质，通过细胞内信号转导系统调节心脏功能，从而提高心肌对随后较长时间缺血的耐受性，对心肌具有早期和延迟保护作用。目前的研究认为缺血预处理的细胞信号转导涉及三个基本环节：触发物质（内源性活性物质）、中介物质（蛋白激酶）和效应物质（离子通道和保护蛋白）。目前认为IPC的机制是短暂的缺血再灌注可使大量的内源性物质如腺苷、缓激肽、阿片等的释放，然后作用于相应的受体，诱导蛋白激酶C（PKC）的激活，再进一步激活其他激酶，最后作用于线粒体的A7P敏感性通道发挥心脏保护作用。PKC是心肌细胞磷脂酰肌醇信号转导系统的重要组成部分，PKC在缺血预处理中的重要作用已经得到证实。近年来的研究显示，IPC还可通过影响心肌细胞膜的重构，减少或抑制心肌细胞凋亡的发生，从而发挥其对心脏的保护作用。对于缺血后处理尤其是远隔器官的缺血后处理的研究目前比较少，其机制是否和缺血预处理一样，有待于研究。有研究推测认为肾脏缺血后处理对心肌的保护作用可能与激动蛋白激酶C有关，通过蛋白激酶C激活再灌注损伤补救酶（RISK）途径，最后使效应器磷酸化，效应器可能主要是线粒体上的ATP敏感性钾通道(mK_ATP)，诱导心肌保护机制。本实验在于通过基础动物实验和临床研究，探讨肾脏缺血后处理能否减轻缺血再灌注性损伤；通过采用蛋白激酶C抑制剂—GF109203X干预，探讨蛋白激酶C是否在肾脏缺血后处理中起重要作用。材料与方法1、实验动物健康新西兰大白兔（由河南医科大学动物实验中心提供）64只，雌雄不拘，体质量2.0～2.5kg。2、主要试剂氯化硝基四氮唑蓝（NBT）（上海灵锦精细化工有限公司），SOD试剂盒、MDA试剂盒（南京建成生物工程研究所）；肌酸激酶同工酶测定试剂盒（浙江东瓯生物工程有限公司），心肌肌钙蛋白Ⅰ快速定量诊断试剂盒（南京基蛋生物技术有限公司）；浓缩型DAB试剂盒、粘片剂（多聚赖氨酸）（北京中杉金桥生物技术有限公司），Tunel试剂盒（德国Roche公司）；一抗Bax、一抗Bcl-2（武汉博士德生物工程有限公司），β-actin、辣根酶标记羊抗兔IgG（北京博奥森生物技术有限公司），PVDF膜、甘氨酸、Tris碱、SDS、甲醇（青岛福林生物化学有限公司），SDS-PAGE凝胶配置试剂盒、预染蛋白质分子量标准、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（5×）、丽春红染色液、考马斯亮蓝快速染色液、RIPA裂解液（强）、PMSF（海门市碧云天生物技术研究所）。3、方法所有动物随机分组（每组8只）：①缺血再灌注组（IR组）：结扎左冠状动脉前降支1小时，再灌注6小时。②缺血预处理组（IPC组）：三次短暂结扎左冠状动脉前降支（5分钟闭塞，10分钟再灌注，循环3次），然后结扎左冠状动脉前降支1小时，再灌注6小时。③肾脏缺血后处理组（RI-Post组）：操作同IR组，此组分为两个亚组：第一亚组（RI-PostF组）在再灌注同时用动脉血管夹反复夹闭左侧肾动脉（阻断30秒，再通30秒，重复三次），再灌注6小时；第二亚组（RI-PostS组）在再灌注10分钟后用动脉血管夹反复夹闭左侧肾动脉（阻断30秒，再通30秒，重复三次），再灌注6小时；④缺血预处理组+肾脏缺血后处理第一亚组（IPC+RI-PostF组）：在IPC组操作的基础上，行RI-PostF组操作，最后心肌再灌注直至6小时；⑤药物干预组（MI组）：结扎左冠状动脉前降支1小时，再灌注前10分钟给予蛋白激酶C抑制剂-GF109203X（0.05mg／kg）耳缘静脉注射持续10分钟，再灌注时行RI-Post组操作，最后心肌再灌注直至6小时。4、动物实验观测指标（1）血流动力学指标各组动物于不同的时间点记录心率与血压，并分析ST段抬高的程度。（2）生化指标各组动物于不同的时间点测定血清超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）浓度。（3）心肌酶测定各组动物于不同的时间点测定血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）和肌钙蛋白Ⅰ（cTNI）浓度。（4）形态学指标实验达终点时，各组动物速取心脏，进行NBT染色，测定心肌梗死面积。（5）Tunel法检测细胞凋亡利用免疫组化原理观察各组动物心肌细胞凋亡情况。（6）光镜学观察各组动物于再灌注末取缺血坏死区心肌组织行HE染色，观察心肌细胞形态学改变。（7）电镜观察各组动物于再灌注末取缺血坏死区心肌组织进行超薄切片观察心肌细胞超微结构改变。（8）Bcl-2、Bax蛋白表达的检测利用Western blot技术检测各组动物心肌细胞凋亡相关基因bcl-2、bax蛋白的表达。利用凝胶分析软件Quantity One进行定量分析。统计处理利用origin75软件进行单因素方差分析。5、数据统计分析实验数据以x±S表示，使用SPSS12.0统计学软件进行分析，组内比较采用单因素方差分析，两组间比较采用q检验（Studengt Newman-KeulS法），将P＜0.05定义为有统计学意义。实验结果1、肾脏缺血后处理对兔心肌缺血再灌注的保护在心肌缺血再灌注时立即行肾脏缺血后处理，能产生与缺血预处理相似的心肌保护作用：①显著改善血流动力学指标，抑制心率及血压的下降；②改善血清生化指标的变化，抑制血清SOD活力的下降和MDA活力的升高；③抑制心肌酶的释放，降低血清CK-MB和cTNI水平的升高程度；④缩小心肌梗死面积。而肾脏缺血后处理与心脏缺血预处理叠加并未显著改善以上检测指标的变化。2、肾脏缺血后处理对心肌缺血再灌注损伤的保护机制与缺血再灌注组相比，肾脏缺血后处理组能降低心肌细胞凋亡，抑制心肌细胞超微结构的变化，并能通过升高心肌细胞bcl-2、降低bax蛋白的表达来对心肌产生保护作用；而蛋白激酶C抑制剂-GF109203X则能取消肾脏缺血后处理的保护作用。结论1、动物实验表明，在兔缺血再灌注模型中，在再灌注的早期立即反复多次阻断再通肾动脉（肾脏缺血后处理），能产生与心肌缺血预处理相似的心脏保护作用；而延迟缺血后处理并不能产生保护作用。2、心肌缺血再灌注时立即行肾脏缺血后处理与心肌缺血预处理共同运用并不能产生额外的心脏保护作用。3、肾脏缺血后处理对心肌保护作用的机制可能与激活蛋白激酶C有关。