口服α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂能直接延缓肠道中淀粉的消化和吸收,进而有效降低餐后高血糖,因此已成为最便捷安全有效的一线降糖药物之一。目前市售α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂主要是阿卡波糖的各类制品,其专利为国外机构所有。而目前国内的α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂制品也多是阿卡波糖的仿制品,竞争力较低。因此开发具有自主知识产权的,生物活性更强的新型α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂具有非常广阔的应用前景。 本研究从糖的消化、吸收、代谢途径入手,建立了α-淀粉酶/糖苷酶抑制药物的高通量筛选模型,并利用该模型对1000余株土壤放线菌的代谢产物进行了广泛筛选,获得了数株能够产生α-淀粉酶/糖苷酶抑制剂的菌株。经复筛确认后,最终选择了一株链霉菌,即菌株ZG0656作为后续研究的出发菌株。 本研究首先对菌株ZG0656生物学分类地位的归属进行研究。根据形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁化学组成特征和16S rDNA全序列相似性比较分析等多相分类方法,确认菌株ZG0656为天蓝黄链霉菌的新变种,命名为天蓝黄链霉菌南开变种(Streptomyces coelicoflavus var.nankaiensis)。该菌株的特征性菌核样特化结构在链霉菌属中比较罕见。 其次,本研究在10L发酵罐水平对菌株ZG0656进行发酵培养。结果表明,发酵液中可积累一定量的α-淀粉酶抑制剂,发酵产物属于典型的次级代谢类型。采用浓缩,树脂吸附,凝胶过滤,减压干燥等方法得到了α-淀粉酶抑制剂混合物AIB656。经初步分析,确认AIB656为含氮的拟低聚糖类物质,能强烈抑制哺乳动物来源的α-淀粉酶,对餐后高血糖的形成有明显改善作用。 利用半制备型高效液相色谱(HPLC)从α-淀粉酶抑制剂混合物AIB656中分离得到6个化学单体。采用酸水解、质谱分析(MS)和核磁共振光谱分析(NMR)等技术,对它们进行了化学结构鉴定,并命名如下：阿卡他定Ⅰ03(1):m=0,n=1,q=2 阿卡他定Ⅱ03(2):m=0,n=2,q=2 *阿卡他定Ⅲ03(3):m=0,n=3,q=2 *木阿卡他定Ⅳ03(4):m=0,n=4,q=2 *阿卡他定Ⅱ23(5):m=2,n=2,q=2 *阿卡他定Ⅱ13(6):m=1,n=2,q=2。 (*为新化合物)采用酶促反应动力学Dixon曲线作图法,证实每一个阿卡他定单体均是α-淀粉酶的混合型非竞争性抑制剂。通过对抑制常数的比较,发现含有9～12个糖环的阿卡他定分子相对抑制强度最高。其中阿卡他定Ⅲ03是迄今发现的综合抑制效果最强的α-淀粉酶抑制剂,其相对抑制强度为阿卡波糖的260倍。在离体水平和体内水平的实验中,阿卡他定Ⅲ03在同剂量的条件下,表现出和阿卡波糖相同的抑制餐后血糖升高的能力,故可将其应用于α-淀粉酶抑制剂类新型药物的开发。最后,本研究以上述六个已知阿卡他定作为对照品,通过分析它们的色谱行为和质谱裂解规律,建立了一个快速、灵敏、简便的超高效液相色谱-电喷雾质谱联用(UPLC/ESI-MS/MS)分析系统。该系统可用于分离和鉴别其它未知阿卡他定家族化合物。利用该分析系统,对菌株ZG0656的阿卡他定家族次级代谢物组进行了轮廓描述。共描述了80个阿卡他定家族化合物的轮廓,包括15个已知化合物和65个新化合物。在这些首次报道的化合物中,包括一些比较新颖和独特的化学结构类型,如含有5个假三糖核心单位的结构类型,直接以脱氧葡萄糖在还原端结尾的结构类型,非还原端缺少一个环醇残基的结构类型,等等。 本研究利用高通量筛选模型筛选得到了一株产生α-淀粉酶抑制剂的天然菌株ZG0656。将其作为出发菌株,系统研究了其分类地位,发酵培养,产物提取工艺；鉴定了主要产物的化学结构,明确了生物活性及构效关系,考察了药理作用；并利用代谢组学对菌株的整体次级代谢背景进行了全面的轮廓描述。这些研究结果基本阐明了菌株ZG0656的背景知识,明确了其应用前景,为开发具有自主知识产权的天然降糖新药奠定了理论和应用基础。