论文部分内容阅读
龙眼（Dimocarpus longan Lour.）作为我国南方重要的经济果树之一，其果实的发育与其内源小分子调控物microRNA（miRNA）具有重要联系。前人研究显示，miRNA参与激素、逆境胁迫、组织器官形态建成等途径调控植物的生长发育；而短肽（miRNA encode regulatory peptide，miPEP）由miRNA初级体（primary microRNA，pri-miRNA）编码而成调控其自身miRNA的表达。已有研究表明miPEP可能参与植物的生长发育、形态建成和养分吸收。而在园艺作物中相关研究较少，仅在龙眼中对miPEP的研究进行了部分的功能验证，但其试验手段匮乏、方法单一，并未对miPEP的活性和功能进行全面的分析。因此本试验在前人的基础上，以龙眼pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a为主要研究对象，通过克隆7个龙眼品种中pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a的全长序列，分析序列的保守性以及潜在编码miPEP，并分析其生成的miRNA在龙眼不同组织部位中的表达模式。同时，对潜在编码miPEP构建pCAMBIA1301过表达载体和突变载体，通过原位转化技术和农杆菌侵染技术遗传转化龙眼幼苗和龙眼胚性愈伤组织（embryogenic callus，EC），分析miPEP的活性及其对相应miRNA的影响；并通过人工合成miPEP处理龙眼EC进一步验证其对下游miRNA的作用。此外，采用瞬时转化烟草叶片进一步研究miPEPs在物种之间的特异性。最后，进一步分析具有活性的miPEP319a-2下游的miR319a的调控靶标及其在龙眼早期体胚发生（somatic embryogenesis，SE）过程中的表达模式。主要结果如下：
1、7个龙眼品种中pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a全长序列克隆及潜在编码miPEP分析
为比较不同龙眼品种miRNA初级体序列及其潜在miPEP的保守性，本研究分别从‘红核子（HHZ）’、‘油潭本（YTB）’、‘十二月（SEY）’、‘四季蜜（SJM）’、‘泉龙104（QL104）’、‘福眼（FY）’和‘泉龙白核（QLBH）’龙眼中克隆获得pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a的DNA序列全长，长度分别为481bp、757bp、752bp和513bp。序列分析发现pri-miR156a和pri-miR156ad在7个龙眼品种中高度保守，而pri-miR319a和pri-miR395a的保守性较差，其中分别存在9个和10个的碱基突变。
潜在miPEP分析发现pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a中分别包含了1、1、3和3个，共8个可能编码miPEPs的sORFs，并且QLBH龙眼编码的miPEP319a-2及SEY、QLBH和QL104龙眼编码的miPEP395a-3-2序列发生了突变。这些突变位点的发现可能为研究miPEP在不同龙眼品种中的功能提供参考。
2、miR156a、miR319a和miR395a在HHZ龙眼不同组织部位中的表达模式分析
对上述pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a生成的成熟体miR156a、miR319a和miR395a进一步在HHZ龙眼不同组织部位中的表达模式分析。实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-time PCR，qRT-PCR）结果发现miR156a、miR319a和miR395a在HHZ龙眼的不同组织部位差异表达：miR156a在龙眼根和大果中表达显著高于其他部位；miR319a在根、叶芽、花蕾、雌花中表达量均较高；miR395a则在根和叶芽中高表达。上述结果显示，miR156a、miR319a和miR395a可能分别在龙眼不同的组织形态建成过程中起到重要作用，miPEP也可能在其中起到相应的作用。
3、HHZ龙眼潜在编码miPEP的原位转化分析
为研究miPEP是否具有生物活性，本试验通过构建pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a中8个可能编码miPEPs的sORFs的过表达载体pCAMBIA1301-35S-miPEP-GUS及其相应的突变载体（起始密码子由ATG突变为ATT），共得miPEPs及M-miPEPs（mutation miPEP）和pCAMBIA1301的重组质粒载体16个。利用原位转化法转化龙眼幼苗，通过PCR法克隆标记基因GUS基因及琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。结果显示，所得的296个龙眼抗性芽中，PCR检测出83个GUS基因阳性，定量分析其GUS基因表达量，结果发现10个抗性芽中GUS的表达量与对照无显著差异，说明样本可能被污染，将其剔除，转化率应为24.66%。最后检测阳性抗性芽中miR156a、miR319a和miR395a的表达量，结果显示miPEP319a-2转基因抗性芽中miR319a的表达量显著高于对照和M-miPEP319a-2转基因抗性芽，表明miPEP319a-2可能具有活性，并促进下游miR319a的表达；在miPEP156a、miPEP156ad、miPEP319a-1、miPEP319a-3、miPEP395a-5-1、miPEP395a-3-1和miPEP395a-3-2转基因抗性芽中，其相应miRNA的表达量与对照和M-miPEPs转基因抗性芽无明显差异，提示这些miPEPs无生物学活性。
4、龙眼EC过表达miPEP和M-miPEP对相应miRNA的影响
为进一步了解pri-miRNA编码的miPEP如何调控龙眼miRNA的表达，利用龙眼EC遗传转化系统，将上述miPEPs和M-miPEPs的过表达载体，利用农杆菌转化法转化龙眼EC，采用qRT-PCR检测miR156a、miR319a和miR395a的表达量。结果显示，转化miPEPs和M-miPEPs的龙眼EC中，其响应miRNA的表达量与miPEP无明显趋势关系，提示转基因龙眼EC在经历根癌农杆菌的毒性作用，潮霉素（Hyg）、特美汀（Tim）以及头孢霉素（Cef）的压力后，转基因龙眼EC内部多糖多酚类物质增加，miRNA被大量沉降，因此对于转基因龙眼EC总RNA提取的方法有必要进一步优化。
5、人工合成miPEP处理龙眼EC对其下游miRNA的影响
对pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a潜在的miPEP进行人工合成，共合成8个miPEPs。利用人工合成miPEP处理龙眼EC，并分析其对相应的miRNA的影响。结果显示，在miPEP319a-2处理下，miR319a表达量显著上调；而其余7个人工合成的miPEPs处理下，相应的miRNA均无明显响应。上述结果进一步提示，龙眼的8个miPEPs中仅有miPEP319a-2具有生物学活性，并促进其下游miR319a表达。
6、HHZ龙眼miPEPs和M-miPEPs在烟草中的瞬时验证分析
为进一步验证miPEP对其下游miRNA的影响是否具有物种特异性。本研究将携带龙眼miPEPs和M-miPEPs过表达载体的农杆菌瞬时转化烟草叶片。进一步通过烟草叶片的GUS染色表明农杆菌已侵染入烟草叶片中；同时，分析烟草叶片中相应miRNA的表达模式，结果表明miR156a、miR319a和miR395a的表达量在对照、miPEPs和M-miPEPs过表达载体侵染的烟草叶片中无明显差异，进一步说明miPEPs在物种之间具有特异性。
7、miR319a及其调控靶标在龙眼早期SE过程中的表达模式分析
为更深入研究miPEP在龙眼早期SE过程中的调控途径，以具有活性的miPEP319a-2下游的miR319a为对象，通过对龙眼miR319a的靶基因预测，验证了龙眼miR319a在转录后水平切割TCP2和TCP4（Dlo_022819.1，Dlo_026743.1）的mRNA。qRT-PCR显示，在龙眼早期SE过程中，miR319a呈显著上调趋势，与其靶基因基本呈现为负调控趋势。上述结果表明，龙眼体胚中可能存在miR319a-TCPs调控途径影响龙眼早期体胚的形态建成，并且miPEP319a-2可能参与到其中。
综上所述，pri-miR156a、pri-miR319a和pri-miR395a序列及潜在miPEPs在7个龙眼品种中具有多样性；通过龙眼原位转化、瞬时表达及化学合成miPEPs处理龙眼EC等手段，验证了龙眼的8个miPEPa中仅miPEP319a-2具有生物学活性，并促进其下游miR319a的表达；进一步通过烟草中的瞬时转化验证了miPEPs在物种之间具有特异性。最后，通过验证miPEP319a-2下游miR319a的靶基因以及其在龙眼早期SE过程中与其调控靶标的表达模式，为在植物体胚中研究miR319a的功能提供参考。该研究结果将为pri-miRNA编码的miPEP应用于在龙眼或是其他植物的生产或是日常管理中提供参考，从而促进农业的高效化和便利化。
1、7个龙眼品种中pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a全长序列克隆及潜在编码miPEP分析
为比较不同龙眼品种miRNA初级体序列及其潜在miPEP的保守性，本研究分别从‘红核子（HHZ）’、‘油潭本（YTB）’、‘十二月（SEY）’、‘四季蜜（SJM）’、‘泉龙104（QL104）’、‘福眼（FY）’和‘泉龙白核（QLBH）’龙眼中克隆获得pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a的DNA序列全长，长度分别为481bp、757bp、752bp和513bp。序列分析发现pri-miR156a和pri-miR156ad在7个龙眼品种中高度保守，而pri-miR319a和pri-miR395a的保守性较差，其中分别存在9个和10个的碱基突变。
潜在miPEP分析发现pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a中分别包含了1、1、3和3个，共8个可能编码miPEPs的sORFs，并且QLBH龙眼编码的miPEP319a-2及SEY、QLBH和QL104龙眼编码的miPEP395a-3-2序列发生了突变。这些突变位点的发现可能为研究miPEP在不同龙眼品种中的功能提供参考。
2、miR156a、miR319a和miR395a在HHZ龙眼不同组织部位中的表达模式分析
对上述pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a生成的成熟体miR156a、miR319a和miR395a进一步在HHZ龙眼不同组织部位中的表达模式分析。实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-time PCR，qRT-PCR）结果发现miR156a、miR319a和miR395a在HHZ龙眼的不同组织部位差异表达：miR156a在龙眼根和大果中表达显著高于其他部位；miR319a在根、叶芽、花蕾、雌花中表达量均较高；miR395a则在根和叶芽中高表达。上述结果显示，miR156a、miR319a和miR395a可能分别在龙眼不同的组织形态建成过程中起到重要作用，miPEP也可能在其中起到相应的作用。
3、HHZ龙眼潜在编码miPEP的原位转化分析
为研究miPEP是否具有生物活性，本试验通过构建pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a中8个可能编码miPEPs的sORFs的过表达载体pCAMBIA1301-35S-miPEP-GUS及其相应的突变载体（起始密码子由ATG突变为ATT），共得miPEPs及M-miPEPs（mutation miPEP）和pCAMBIA1301的重组质粒载体16个。利用原位转化法转化龙眼幼苗，通过PCR法克隆标记基因GUS基因及琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。结果显示，所得的296个龙眼抗性芽中，PCR检测出83个GUS基因阳性，定量分析其GUS基因表达量，结果发现10个抗性芽中GUS的表达量与对照无显著差异，说明样本可能被污染，将其剔除，转化率应为24.66%。最后检测阳性抗性芽中miR156a、miR319a和miR395a的表达量，结果显示miPEP319a-2转基因抗性芽中miR319a的表达量显著高于对照和M-miPEP319a-2转基因抗性芽，表明miPEP319a-2可能具有活性，并促进下游miR319a的表达；在miPEP156a、miPEP156ad、miPEP319a-1、miPEP319a-3、miPEP395a-5-1、miPEP395a-3-1和miPEP395a-3-2转基因抗性芽中，其相应miRNA的表达量与对照和M-miPEPs转基因抗性芽无明显差异，提示这些miPEPs无生物学活性。
4、龙眼EC过表达miPEP和M-miPEP对相应miRNA的影响
为进一步了解pri-miRNA编码的miPEP如何调控龙眼miRNA的表达，利用龙眼EC遗传转化系统，将上述miPEPs和M-miPEPs的过表达载体，利用农杆菌转化法转化龙眼EC，采用qRT-PCR检测miR156a、miR319a和miR395a的表达量。结果显示，转化miPEPs和M-miPEPs的龙眼EC中，其响应miRNA的表达量与miPEP无明显趋势关系，提示转基因龙眼EC在经历根癌农杆菌的毒性作用，潮霉素（Hyg）、特美汀（Tim）以及头孢霉素（Cef）的压力后，转基因龙眼EC内部多糖多酚类物质增加，miRNA被大量沉降，因此对于转基因龙眼EC总RNA提取的方法有必要进一步优化。
5、人工合成miPEP处理龙眼EC对其下游miRNA的影响
对pri-miR156a、pri-miR156ad、pri-miR319a和pri-miR395a潜在的miPEP进行人工合成，共合成8个miPEPs。利用人工合成miPEP处理龙眼EC，并分析其对相应的miRNA的影响。结果显示，在miPEP319a-2处理下，miR319a表达量显著上调；而其余7个人工合成的miPEPs处理下，相应的miRNA均无明显响应。上述结果进一步提示，龙眼的8个miPEPs中仅有miPEP319a-2具有生物学活性，并促进其下游miR319a表达。
6、HHZ龙眼miPEPs和M-miPEPs在烟草中的瞬时验证分析
为进一步验证miPEP对其下游miRNA的影响是否具有物种特异性。本研究将携带龙眼miPEPs和M-miPEPs过表达载体的农杆菌瞬时转化烟草叶片。进一步通过烟草叶片的GUS染色表明农杆菌已侵染入烟草叶片中；同时，分析烟草叶片中相应miRNA的表达模式，结果表明miR156a、miR319a和miR395a的表达量在对照、miPEPs和M-miPEPs过表达载体侵染的烟草叶片中无明显差异，进一步说明miPEPs在物种之间具有特异性。
7、miR319a及其调控靶标在龙眼早期SE过程中的表达模式分析
为更深入研究miPEP在龙眼早期SE过程中的调控途径，以具有活性的miPEP319a-2下游的miR319a为对象，通过对龙眼miR319a的靶基因预测，验证了龙眼miR319a在转录后水平切割TCP2和TCP4（Dlo_022819.1，Dlo_026743.1）的mRNA。qRT-PCR显示，在龙眼早期SE过程中，miR319a呈显著上调趋势，与其靶基因基本呈现为负调控趋势。上述结果表明，龙眼体胚中可能存在miR319a-TCPs调控途径影响龙眼早期体胚的形态建成，并且miPEP319a-2可能参与到其中。
综上所述，pri-miR156a、pri-miR319a和pri-miR395a序列及潜在miPEPs在7个龙眼品种中具有多样性；通过龙眼原位转化、瞬时表达及化学合成miPEPs处理龙眼EC等手段，验证了龙眼的8个miPEPa中仅miPEP319a-2具有生物学活性，并促进其下游miR319a的表达；进一步通过烟草中的瞬时转化验证了miPEPs在物种之间具有特异性。最后，通过验证miPEP319a-2下游miR319a的靶基因以及其在龙眼早期SE过程中与其调控靶标的表达模式，为在植物体胚中研究miR319a的功能提供参考。该研究结果将为pri-miRNA编码的miPEP应用于在龙眼或是其他植物的生产或是日常管理中提供参考，从而促进农业的高效化和便利化。