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第一部分基于PI3K/AKT通路探讨针刺调控内质网应激-自噬对哮喘小鼠气道炎症的影响目的:支气管哮喘发病率高,其慢性病程反复发作的特点造成了巨大的社会经济压力。研究证明,内质网应激及自噬参与了多类亚型的支气管哮喘病理生理过程,直接调控气道炎症的发生并影响类固醇耐受性。PI3K/AKT通路是调节自噬的主要信号通路,PI3K通过磷酸化激活AKT,增加m TORC活性,从而抑制内质网应激介导的自噬的启动。本研究通过干预PI3K/AKT通路探讨针刺对OVA致敏哮喘小鼠气道炎症的影响,并观察内质网应激和自噬过程的作用。方法:1.通过OVA-AAI联合致敏方式构建支气管哮喘Balb/c小鼠模型,针刺大椎、肺俞、足三里及使用PI3K/AKT通路抑制剂LY294002进行干预治疗;2.通过HE染色、Masson染色和天狼星红染色检测肺组织病理改变,ELISA检测血清及支气管肺泡灌洗液（BALF）炎性因子评估小鼠炎症水平;3.通过肺组织电镜、免疫荧光染色、PCR及Western blot的方法验证各组小鼠自噬水平表达差异;4.通过PCR、免疫组化和Western blot检测各组小鼠内质网应激水平改变及PI3K/AKT通路关键分子的表达。结果:1.组织学病理检测表明,与空白组相比,模型组肺组织中出现上皮细胞紊乱,炎性细胞聚集,可见较多透明分泌物及嗜酸性粒细胞浸润,管壁增厚,胶原纤维沉积明显增多,气管壁肌纤维增厚明显等支气管哮喘气道炎症和重塑改变,针刺组及抑制剂组各病理表现明显减少;联合组肺组织及气道改变程度介于针刺组与模型组之间。ELISA检测结果血清中Ig-E水平明显升高（P<0.01）,促炎因子TGF-β、IL-4、IL-17A升高,抗炎因子IFN-γ降低（P<0.01）,各组改变与病理一致。说明针刺治疗可减轻哮喘气道过敏性炎症和气道重塑程度,且与PI3K/AKT通路相关。2.蛋白水平上,与空白组相比,模型组内质网应激及自噬水平明显升高,PI3K/AKT通路代表性蛋白PI3K、AKT、m TOR水平明显升高（P<0.01）,而各干预组内质网应激及自噬水平明显降低,PI3K/AKT通路代表性蛋白明显降低（P<0.01）,说明内质网应激与自噬具有正相关关系,且针刺可减轻内质网应激和自噬程度且与PI3K/AKT通路有关,抑制PI3K/AKT通路可抑制内质网应激及自噬过程。3.基因水平上,与空白组相比,模型组内质网应激及自噬水平明显升高,PI3K/AKT通路代表性基因明显升高（P<0.01）,而与蛋白结果明显不一致的是,在针刺组及联合组中,内质网应激及自噬基因无明显变化（P>0.05）,提示针刺治疗对哮喘内质网应激及自噬的调控可能不通过改变基因表达水平,而是通过干预转录后翻译等过程实现。结论:针刺可通过介导支气管哮喘小鼠内质网应激-自噬过程减轻气道炎症和气道重塑,且与PI3K/AKT通路调控有关。第二部分基于PI3K/AKT通路探讨内质网应激-自噬在上皮细胞BEAS-2B中的作用及对T细胞亚群的影响目的:气道炎症与免疫调控是支气管哮喘治疗的研究重点。支气管哮喘与T淋巴细胞主要介导的Ig-E相关免疫应答密切相关,Th2炎症（Th2-inflammation）被证明与一部分严重哮喘患者相关,主要表现为Ig E水平和血清炎症水平的明显升高。结合动物实验验证的针刺对气道炎症及内质网应激-自噬的调控作用,本研究选取支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞,使用抑制剂及激动剂进行正反向干预,并提取条件性转基因Atg5-/-小鼠原代CD4+T淋巴细胞进行干预培养,探讨PI3K/AKT通路介导内质网应激-自噬在炎症环境下的作用及对T细胞亚群的影响。方法:1.培养支气管上皮细胞系BEAS-2B细胞,采用LPS干预造成炎症模型,CCK8检测细胞增殖以确定干预浓度和时间,并检测细胞上清炎症因子水平;2.提取条件性转基因Atg5-/-小鼠原代CD4+T淋巴细胞进行分选及干预,CFSE染色检测细胞增殖以确定干预时间;3.通过PCR及Western blot检测各组BEAS-2B细胞内质网应激水平及PI3K/AKT通路典型分子表达水平差异;4.通过流式细胞术检测各组小鼠原代CD4+T淋巴细胞亚群Th1/Th2、Treg/Th17平衡改变。结果:1.CCK8结果提示干预浓度为1μg/ml LPS溶液和0.25μg/ml Tm溶液,BEAS-2B细胞干预24h使用,CFSE染色结果提示淋巴细胞干预72h使用。2.与Con组相比,LPS组和TM组促炎因子TGF-β、IL-4、IL-17A升高,抗炎因子IFN-γ降低,有统计学差异（P<0.01）;与TM组相比,LY组和GS组促炎因子TGF-β、IL-4、IL-17A降低,抗炎因子IFN-γ升高,RA组促炎因子TGF-β、IL-4、IL-17A升高,抗炎因子IFN-γ降低,有统计学差异（P<0.01）。3.蛋白水平上,与Con组相比,LPS组自噬蛋白LC3B、Beclin-1蛋白表达水平明显升高,p62蛋白表达水平明显降低,有统计学差异（P<0.01）;与LPS组相比,TM组LC3B、Beclin-1蛋白表达水平明显升高,p62蛋白表达水平明显降低,有统计学差异（P<0.01）,TU组LC3B、Beclin-1蛋白表达水平明显降低,p62蛋白表达水平明显升高,有统计学差异（P<0.01）。LPS组和TM组Beclin-1、LC3B、p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-m TOR/m TOR蛋白表达水平明显升高,有统计学差异（P<0.01）,p62蛋白表达水平明显降低,有统计学差异（P<0.01）;与TM组相比,RA组p-m TOR/m TOR蛋白表达水平明显降低,有统计学差异（P<0.01）,LY组p-PI3K/PI3K蛋白表达水平明显降低,有统计学差异（P<0.01）,GS组p-AKT/AKT蛋白表达水平明显降低,有统计学差异（P<0.01）。基因水平上,LC3 B、Beclin-1、p62、Pi3k、Akt、Mtor基因表达水平与蛋白表达水平基本一致。结果表明抑制PI3K/AKT通路可抑制内质网应激对自噬的激活。4.转基因小鼠原代T淋巴细胞经干预后,TM组中Th1/Th2及Treg/Th17比值水平明显降低,Treg细胞减少,Th17细胞增多,Th1细胞减少,Th2细胞增多,有统计学差异（P<0.01）;与TM组相比,Atg5-/-组及TL组中亚群失衡得到逆转,表明抑制PI3K/AKT通路可抑制内质网应激及自噬过程,并可起到纠正T淋巴细胞分化平衡的作用。结论:抑制PI3K/AKT通路可抑制内质网应激对自噬的激活并降低支气管上皮细胞炎症水平,纠正T淋巴细胞分化平衡。