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苜蓿的秋眠性是在秋季日照变短和温度下降时一种适应性生长特性,这种生长特性与其抗寒性和生产性能密切相关。近年来的研究表明,苜蓿秋眠性和抗寒性是两个相对独立的性状,光周期是影响秋眠的主要因子,PHYA、PHYB（Phytochrome A,PHYA;Phytochrome B,PHYB）作为主要光受体可能通过光周期调控内源激素的合成参与了苜蓿的秋眠。对不同秋眠类型苜蓿在秋天的光周期反应中关键调控基因的研究,可以为探讨苜蓿秋眠性的分子机理的开辟新途径。从光信号转导途径来研究苜蓿秋眠的调控机制,将为休眠的调控网络的传导途径的未知区域增添新的内容。为了探讨在紫花苜蓿秋眠过程中哪些靶基因和与此相关的酶可能调控或参与了秋眠过程;是否在转录水平miRNAs与靶基因mRNA结合,影响了靶基因在转录水平的表达,进而了调控苜蓿的秋眠,进行了本研究。研究利用本实验室已克隆全长的PHYA、PHYB和已进行的秋眠型紫花苜蓿品种Maverick和非秋眠型苜蓿品种CUF101在夏秋季节取样的转录组测序数据,筛选出光信号转导途径关键基因（差异倍数,Fold Change≥2）蓝光受体（Cryptochrome2B）CRY2B和远红光、红光受体PHYA、PHYB作为靶基因研究对象。在此基础上,本研究采用Small RNA测序技术对秋眠型紫花苜蓿品种Maverick和非秋眠型苜蓿品种CUF101在夏秋季节取样并进行了测序:（1）筛选出与秋眠相关的差异miRNAs28个,并进行了荧光PCR验证和Northern杂交鉴定;（2）在紫花苜蓿转录组测序和Small RNA测序联合分析的基础上,筛选出光信号转导途径PHYA、PHYB、CRY2B作为研究对象,并克隆出PHYA的下游调控因子FHY1的CDS区,然后在实验室进行PHYA、PHYB沉默得到了转基因植株,测定了不同月份（4月、7月、9月）紫花苜蓿PHYA、PHYB、CRY2B、FHY1基因表达量和沉默PHYA、PHYB的转基因植株PHYA、PHYB、CRY2B、FHY1基因表达量;（3）在（2）基础上,成功构建了CRY2B过表达载体并对其进行了紫花苜蓿植株的转化,获得CRY2B的转基因植株;（4）糖代谢方面,测定了与糖类物质代谢有关的基因alpha amylase、beta amylase酶活及其mRNA表达量;（5）最后,测定了2种秋眠型紫花苜蓿品种IAA、GA3、ZR、ABA的含量。试验具体包括以下五个部分,结果如下:试验一紫花苜蓿的Small RNA高通量测序及秋眠相关差异microRNAs的筛选与鉴定通过对紫花苜蓿两个标准品种叶片（在不同的生长状态取样,5月正常生长状态和9月秋眠状态,与转录组测序样本一致）的高通量测序,建立了4个small RNA数据库,分别产生了7536934、6572924、7536934和6627260高质量的序列,确定了583个与休眠相关的microRNA;根据GO富集分析和KEGG路径之间的分析,推断秋眠的调控机制属于应对外界环境变化的生物调控代谢途径。研究也发现了28个关键的调控休眠microRNA,包括20个已知的microRNA和8个novel microRNA;这些,通过对20个已知的microRNA调控靶基因功能的分析,推测它们对秋眠反应的microRNA参与了植物中不同的细胞过程,包括生长、休眠、开花、转录、蛋白质降解、细胞周期转换、信号转导和适应。这些miRNA在秋眠调控网络中可能扮演重要的角色,有待于对这些microRNA进一步进行功能分析和研究。结合本实验室的研究基础和转录组测序的结果,我们确定了光信号转导途径的重要基因PHYA、PHYB、CRY2B、FHY1作为调控苜蓿秋眠的光信号转导途径中的关键基因进行下一步试验。试验二光信号转导途径PHYA、PHYB、CRY2B、FHY1等基因表达量检测对PHYA、PHYB转基因植株PHYA、PHYB、CRY2B、FHY1的mRNA表达量和不同月份（4月、7月、9月）采集的紫花苜蓿叶片PHYA、PHYB、CRY2B、FHY1的mRNA表达量进行了测定。根据结果推断,在光信号的转导途径,PHYA、PHYB、CRY2B都参与了对苜蓿秋眠的调控,PHYA、PHYB可能在在转录前参与了对苜蓿秋眠的调控,或者在转录水平与对应miRNA结合;而CRY2B可能在转录水平参与了苜蓿秋眠的调控。它们之间共同起作用,在紫花苜蓿秋眠的调控网络中缺一不可。试验三不同秋眠级紫花苜蓿alpha amylase、beta amylase酶活及其mRNA表达本研究对对不同月份（3月、4月、6月、7月、9月）不同秋眠级紫花苜蓿标准品种Maverick（fall dormancy class 1,FD1）、Vernal（FD2）、UC-1887（FD10）、UC-1465（FD11）的alpha amylase、beta amylase酶活及其mRNA表达量进行了测定。结果发现,秋眠1级和2级标准品种Maverick与Vernal的不同月份（3月、4月、6月、7月、9月）β-淀粉酶在转录水平和蛋白水平表达趋势一致,在秋眠状态下表达量增高,表明了与抗冻性有关的酶在秋眠性和抗寒性上的一致性。试验四CRY2B过表达载体构建及其对紫花苜蓿植株的转化本试验利用植物表达载体pCAMBIA3301（含有CaM 35 S启动子和Nos polyA终止子）,通过在CRY2B基因的引物两端加入NcolI的同尾酶BspHI和PmlI位点,成功构建了CRY2B的过表达载体,并利用农杆菌介导的直接分化芽的方法获得秋眠1级品种——驯鹿的转化植株。为下一步研究CRY2B基因在转录水平调控秋眠的进一步研究奠定了一定的基础。试验五不同秋眠级品种紫花苜蓿内源激素IAA、GA3、ZR、ABA含量的测定本试验对不同月份（3月、4月、6月、7月、9月）对Maverick、Vernal、UC-1887、UC-1465AA、GA3、ZR、ABA含量进行了测定。结果发现,ABA与IAA、GA3、ZR之间呈负相关的关系,在紫花苜蓿生长的不同时段,ABA与IAA、GA3、ZR所起的作用也不同,在紫花苜蓿生长的前期（3月、4月）IAA、GA3、ZR三种激素协同对紫花苜蓿生长起促进作用。在高温和秋眠的诱导下,IAA、GA3、ZR作用被抑制,为抵抗高温和秋眠的影响,ABA作用开始占优势,9月份ABA含量增加,但相较于7月高温的影响,9月秋眠时对ABA的诱导作用较弱,其变化规律与PHYB的合成规律相似,与本实验室前期研究推测的PHYB通过调控ABA的合成来调控苜蓿的秋眠一致。综合分析,,ABA与IAA、GA3、ZR参与了对苜蓿秋眠的调控,它们共同调节紫花苜蓿的生长与休眠过程。苜蓿秋眠性的调控机制是一个复杂的网络,在光信号的转导途径,PHYA、PHYB在转录之前参与了对苜蓿秋眠的调控,或者在转录水平与对应miRNA结合（在28个关键的调控秋眠microRNA中,高度保守的microRNAs,如miR156、miR164、miR172等都参与了植物生长、休眠、开花等过程）,而CRY2B在转录水平参与了苜蓿秋眠的调控。PHYA、PHYB、CRY2B都参与了对苜蓿秋眠的调控,它们之间相互影响、共同作用;在糖代谢方面,秋眠型苜蓿（秋眠品种1级和2级标准品种）β-淀粉酶在转录水平和蛋白水平表达趋势一致,与夏季的相对休眠相比,β-淀粉酶mRNA的表达转录水平与蛋白水平酶活均增加,α-淀粉酶mRNA的表达转录水平与蛋白酶活水平的变化规律不明显;在高温和秋眠的诱导下,9月份ABA含量增加,但相较于7月ABA含量的增加幅度,9月秋眠对ABA的诱导作用较弱,其变化规律与PHYB的合成规律相似,试验也验证了PHYB通过调控内源激素间接调控了苜蓿的秋眠的推论。