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草鱼出血病病毒(Grass carp reovirus, GCRV)是水生呼肠孤病毒属中致病力最强双链RNA(dsRNA)病毒,因曾引起中国西南的85%草鱼幼鱼发生草鱼出血病而被首次发现。目前的疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗,灭活疫苗不能进入主要组织相容性复合体I(MHC I)类抗原呈递途径,不能有效的诱导细胞毒性T细胞(CTL)反应,因此,免疫效果相对不理想、免疫力持久性差；减毒疫苗生产成本高,有毒力返祖现象,安全性较差,有回复致病性的潜在危险。鱼体免疫接种的常规方法是浸泡免疫和注射免疫,浸泡免疫方法操作简单,但需要大量的疫苗；但注射免疫要求鱼体要有一定的规格,操作强度大、技术要求高、技术推广困难,而且鱼的捕捞过程及注射对鱼体均造成较大损伤。因此,生产上急需开发安全可靠、高效多价、使用简便的草鱼出血病口服亚单位/DNA联合疫苗。1.草鱼出血病病毒vp6核酸疫苗的免疫效果评估为了评估草鱼出血病病毒(GCRV)vp6基因核酸疫苗的免疫效果,将vp6基因克隆进pFastBacTMDual载体杆状病毒多角体蛋白(Polh)启动子下游,同时将团头鲂(Megalobrama amblycephala)的β-肌动蛋白启动子控制的vp6基因克隆进杆状病毒P10启动子下游获核酸疫苗载体pFastBac-FA-VP6-ph-VP6.按每尾分别注射疫苗载体10、30、60μg免疫草鱼(体长14～20cm,体重60～120g),同设pFastBacTMDual载体(30μg/尾)阴性对照组及空白对照组(0.4ml/尾无菌水)。于免疫后不同时间通过RT-PCR检测免疫鱼体中vp6基因的表达,并于免疫后第14、21、28、49、70d分别通过间接凝集反应检测血液中的抗体水平和在免疫第21d感染GCRV评估免疫保护效果。结果显示,核酸疫苗免疫草鱼后,各免疫组均有抗体产生,抗体效价在免疫后第28d达到最高；攻毒后每尾注射疫苗载体10、30、60μg组的死亡率分别为0%、0%、5%,pFastBacTMDual载体对照组和空白对照组分别为30%和100%。表明构建的核酸疫苗对草鱼病毒性出血病有较好的免疫保护效果。2.原核表达GCRV VP6蛋白对草鱼出血病的免疫保护作用为了探讨草鱼出血病病毒(GCRV)VP6亚单位疫苗对草鱼出血病的免疫保护作用,将vp6基因克隆进原核表达载体pET-28a(+),构建了重组质粒pET28a(+)-VP6。SDS-PAGE和Western blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为43kDa,主要以包涵体形式存在,重组蛋白占菌体总蛋白的20%左右；Ni2+柱纯化后的重组蛋白,以每尾500μg肌肉注射免疫草鱼(14～20cm,60～120g),并在第14、21、28、49、70d通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,免疫注射后第14d可检测到鱼体产生的特异性抗体,第21d达到最高峰,第70d仍可检测到抗体的存在；免疫注射第21d人工接种GCRV,免疫后的草鱼对出血病的保护力达100%。研究结果为草鱼出血病亚单位疫苗的研发奠定了基础。3.GCRV VP6蛋白亚单位/DNA联合口服疫苗及免疫效果评价杆状病毒具有高效表达外源基因以及安全有效向脊椎动物细胞传递基因的功能,为了研发安全可靠、高效多价、使用方便的VP6蛋白亚单位/DNA联合口服疫苗,本研究分别用团头鲂的β-actin启动子和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)的多角体蛋白启动子控制GCRVvp6基因构建供体质粒pFastBac-FA-VP6-ph-VP6,通过Bac to Bac系统获重组杆状病毒BacFish-VP6。重组病毒感染5龄家蚕后,采集血液,SDS-PAGE和Western blotting显示,重组VP6蛋白的分子量约为53kDa。重组病毒感染蚕蛹120h后,VP6蛋白的表达水平达到最高值,达血淋巴总蛋白的5%左右,冷冻干燥制成冻干粉,然后分别以1%、5%、10%的比例掺入饲料中(含2.5%淀粉),口服免疫草鱼,通过间接凝集反应检测抗体水平,结果显示,抗体产生水平呈剂量依赖的方式,并在免疫后第3-4周抗体水平达到最高,至3个月后仍能检测到特异性抗体的存在；RT-PCR检测结果显示,在口服免疫的鱼血液中可特异性地检测到vp6基因的mRNA,免疫组化法在免疫鱼的肝、肾组织中可检测到VP6蛋白,表明用感染重组杆状病毒BacFish-vp6的蚕蛹冻干粉口服免疫,重组杆状病毒BacFish-vp6能进入鱼体,并正确表达VP6蛋白,刺激鱼体产生免疫反应。初步的研究结果表明,表达VP6蛋白的蚕蛹冻干粉具有蛋白亚单位/DNA疫苗的双重功效,口服免疫能诱导鱼产生特异性免疫反应。