论文部分内容阅读
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV-2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的主要病原,不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡,还与仔猪先天性震颤(Congenital tremors CT)、猪皮炎与肾病综合征(Porcine dermatitis and nephropathy syndrome,PDNS)和猪呼吸道疾病综合征(Porcine respiratory disease complex,PRDC)有关,更重要的是PCV-2的感染可以造成仔猪免疫抑制。PCV-2常和猪繁殖与呼吸综合征病毒、细小病毒、伪狂犬病毒混合感染,造成猪的免疫失败,继而引起其他病原的继发性感染,造成的间接损失非常大。目前,PCV-2已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原。PCV-2基因组为闭合环状单链DNA,全长1 767 bp或1 768 bp,含2个开放阅读框,即ORF1和ORF2。ORF1编码病毒复制相关蛋白。ORF2编码病毒衣壳蛋白,即病毒的结构蛋白,衣壳蛋白有很好的免疫原性,但在PCV-1和PCV-2之间不存在交叉保护。因此,研究PCV-2的ORF2基因对猪圆环病毒的检测和疫苗研究具有重要意义。杆状病毒是一种自然感染昆虫细胞的病毒,该病毒的吸附和侵入细胞的作用与囊膜糖蛋白gp64有关。gp64由N-端信号肽和具有跨膜区、胞质区的成熟蛋白组成。gp64已被开发成病毒表面展示系统以展示各种目的蛋白。将外源基因片段插入病毒衣壳蛋白的信号肽与成熟蛋白之间,经后加工作用信号肽被切除,形成的融合蛋白能稳定地表达在杆状病毒粒子表面,筛选后就可以得到能表达目的蛋白的重组杆状病毒,这种表达方式稳定、可靠,用来开发基因工程疫苗简捷、快速,现在已被广泛地应用到研发和实践。本研究对杆状病毒展示系统展示PCV-2衣壳蛋白进行了研究,并对展示的蛋白进行了动物免疫试验,获得以下结果:(1)设计一对特异性引物P1、P2,以提取的PCV-2 YL株DNA为模板,采用PCR方法成功获得了PCV-2 YL株的ORF2基因片段,将该片段胶回收后与pGEM-T载体连接,转化DH5α感受态细胞,经筛选获得阳性克隆,PCR和酶切鉴定正确的质粒测序。测序正确的质粒命名为pGEM-T-ORF2。结果显示目的片段大小为702bp,共编码234个氨基酸,表达的目的蛋白分子质量为28ku。DNAStar软件分析表明,PCV-2 YL株ORF2基因与GenBank中其他的PCV-2毒株的核苷酸同源性在89.9%～98%之间,编码的氨基酸同源性在88.5%～98.3%之间。(2)将pGEM-T-ORF2质粒和载体pET-32a用BamHI / XhoI双酶切后,连接构建pET-32a-ORF2重组表达质粒。重组质粒转染大肠埃希菌,用IPTG诱导表达。经SDS-PAGE检测表明ORF2在大肠埃希菌中得到表达,Western blot检测证实表达的蛋白能与猪圆环病毒2型阳性血清发生特异性结合。(3)参考Bac-to-Bac真核表达载体的酶切位点和ORF2基因序列设计一对引物,以pGEM-T-ORF2为模板进行PCR扩增,将回收的扩增产物与Bac-to-Bac真核表达载体分别进行XhoI、PstI双酶切,回收酶切片段并将其连接,构建了重组杆状病毒BscSC-ORF2。用重组病毒感染昆虫细胞后,经免疫荧光-共聚焦显微镜观察,重组衣壳蛋白能有效地表达在昆虫细胞膜上。将培养的病毒高速离心浓缩,经免疫金电子显微镜观察,证明重组蛋白表达在了杆状病毒囊膜上。(4)用重组杆状病毒免疫小鼠后,中和试验表明,小鼠产生了PCV-2的特异性抗体,抗体的中和效价达到1:12.8;淋巴细胞转化增殖试验表明,重组杆状病毒能诱发机体产生较强的细胞免疫应答。本研究成功构建了表面展示PCV-2 Cap蛋白的重组杆状病毒,为进一步应用该重组杆状病毒作为亚单位疫苗预防PCV-2的感染奠定了基础。