广东烟草花叶病主要病原鉴定及品种抗性评价

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本研究对72个所采样品中通过柯赫氏法则验证能接种于Havana 38烟草上发病的62个样品,采用常规机械摩擦法分别接种于心叶烟、豇豆、苋色藜、菜豆、枸杞上,并通过TMV-ELISA,CMV-ELISA、RT-PCR辅助检测,从而确定病原的种类:在其62个花叶病样中,有61.29%的病样为单TMV侵染,20.97%的病样为单CMV侵染,17.74%的病样为TMV和CMV复合侵染。 优选对比分析了多种总RNA提取方法,优选了最为高效和低成本的异硫氰酸胍法,并作了一系列改进模索,成功建立了烟草总RNA提取的两种新异硫氰酸胍法,即硫氰酸胍两次精提法和异硫氰酸胍一次快提法。 进行了PCR体系中各因子的摸索,改进和新建了各一套三重PCR体系。改进的三重PCR的PCR体系(引物量配比:TMV:CMV:PVY=1.5:0.5:0.8, 1.5%琼脂糖胶电泳70 V,70分钟电泳。)成本降低为原法的1/2,时间减少为原来的3/4。新建的三重PCR体系(PCR引物量配比:TMV:CMV:PVY=2:0.1:1,1.0%琼脂糖胶电泳70 V,40分钟电泳。)成本与改进法的相当,但时间又减少了30 min。两个体系都可以成功达到检测目的。 采用机械摩擦接种法将49个TMV分离物分别接种各类鉴别寄主。结果发现:49个分离物只在普通烟NC89、三生烟、洋酸浆、番茄上表现系统花叶,不侵染广丰2号茄子、富丰紫长茄和早多收茄子。这初步表明这49个分离物与阳性TMV普通株系对照一样同为TMV普通株系。 通过完整CP基因序列片段的克隆测序,分别测得随机选取的三个TMV代表分离物(Ⅰ-1,Ⅰ-2和Ⅱ-6)的CP基因序列片段大小分别为:480 bp、475 bp和479 bp,与其它TMV分离物相应CP基因的同源率都高达96%~08%。利用生物学软件DNASTAR对序列进行同源性分析、进化树分析和对准比较,结果表明:三个分离物都与阳性对照TMV普通株系及韩国的ssp.NC82普通株系同源率最高(98.1~99.6%),这进一步表明以这三个分离物为代表的49个分离物与阳性TMV普通株系对照一样同为TMV普通株系。据完整CP基因核苷酸序列构建的系统进化树将35个株系和分离物划分为5个基因型,并认为广东省引起烟草花叶病的主要病毒种类TMV的株系与vulgare、ssp.NC82、福建分离物等16个株系及分离物同属于TMV亚组Ⅰ。以枯斑法接种心叶烟作浓度参照,采用TMV侵染的普通烟叶系列稀释液(CK、1:10、1:100、1:1 000、1:10 000、1:1 000 000)作浓度梯度,选用K326作中感品种对照,采用机械摩擦接种法接种7个烟草品种(K326、云烟87、RG17、9601、9032、MSK326、MS96-7),从而测定这些品种对TMV的抗性。结果表明:从各项自然及接种TMV后的农艺产量性状来看,云烟87、RG17和9601表现相对较好。其中以1:10 000稀释度作为评价浓度进行攻毒接种,接种70天后的病情指数:MS96-7最低为81.06, 9032最高为95.46;接种30天后统计发病率:MS96-7最低为71.21%,RG17最高为100.00%。综合结果显示,没有一个品种表现对TMV免疫或高抗水平,其中MS96-7表现为中抗,云烟87、RG17、9601、9032、K326和MSK326表现为中感。 不同烟草品种选用评价浓度1:40稀释度进行了CMV接种。对接种后20天的病情指数和第9天的发病率进行分析,结果表明,云烟87抗CMV扩展特性最强,9601抗CMV扩展特性最弱;RG17为CMV高感品种,其余5个(含新育成的品种MS96-7、MSK326)为CMV中感至高感间的品种。总体上,广东省缺乏免疫、高抗或中抗CMV的主栽品种。
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