研究背景与目的新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy,HIE)，定义为发生于围产期的窒息所引起的缺氧、脑血流减少或短期脑血流灌注中断所致的脑缺氧缺血性损伤，呈现一系列中枢神经异常的临床症状与体征，是引起急性围生期死亡和远期神经系统后遗症的重要原因之一。因此，缺氧缺血性脑损伤（hypoxic-ischemic brain damage,HIBD）的防治策略和干预机制一直以来是临床医生和研究人员关心的问题。在新生儿缺氧缺血性脑损伤时，一系列基因转录活化从而引发保护性或有害性反应，其中保护性的反应包括刺激红细胞生成、抗凋亡及血管形成等，有害性的反应包括凋亡和坏死，介导这些基因转录的一个关键因子是缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)。生理情况下，HIF-1α参与了早期脑发育和神经元祖细胞的增殖。在HIBD时，HIF-1α蛋白稳定性增加，并和HIF-1β二聚体化形成HIF-1，随后作用于靶基因缺氧反应元件调控血管内皮生长因子、葡萄糖载体蛋白-1、促红细胞生成素等的表达而发挥脑保护作用。所以，探寻上调HIF-1α表达的药物，将为HIE提供一个重要的治疗靶向。有研究表明，部分中、重度HIE存在着甲状腺功能减低，使用左甲状腺素片干预可促使HIE的恢复。迄今为止，国内未见甲状腺素（thyroxine,T4）影响HIF-1α表达的研究，国外T4对HIF-1α表达影响的研究较少，并且研究对象多为体外的细胞，牵涉到的机制多为甲状腺素可以通过激活三磷酸肌醇激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3-kinase/Akt,PI3K/Akt）信号通路，使磷酸化的蛋白激酶B(p-Akt)表达增加，进而促进HIF-1α表达。然而国内外均未见在HIBD脑组织中有T4对HIF-1α表达影响及其相关机制的报道。本实验通过建立新生大鼠缺氧缺血性脑损伤模型，甲状腺素作为干预药物，检测大鼠脑组织内的HIF-1α蛋白、mRNA及p-Akt蛋白表达。旨在探讨T4对新生大鼠HIBD脑组织HIF-1α表达的影响及可能的作用途径，为临床上应用T4干预HIE提供动物实验证据。材料和方法64只健康7日龄清洁级Sprague-Dawley(SD)大鼠，雌雄不限，体质量12～16g，按随机原则分为：假手术组、模型对照组(M)、溶剂干预组和T4干预组(T4)，每组分别有16只（即n=16）。模型对照组：首先钝性分离并结扎新生大鼠左边的颈总动脉，放回母鼠旁1小时后，把新生大鼠放入自制的有机玻璃缺氧舱中，充以氮氧混合气（92%N2、8%O2），时间为2小时；假手术组：仅仅钝性分离左侧的颈总动脉，但不进行后续的结扎及缺氧处理；从HIBD模型制作成功后的当日开始，T4干预组和溶剂干预组均通过腹腔注射的干预方式，分别给予2ug/100gT4溶液和相同体积溶剂（指溶解甲状腺素粉末所需的碱性乙醇溶剂，具体见正文部分的甲状腺素溶液的配备），每天1次，一共5天。各组大鼠饲养至P11（出生当天记为P0）时，每组随机均取8只，经乙醚吸入方式，适度麻醉后，从左心室先后灌注约40mL生理盐水及约40ml40g/L的甲醛，然后开颅取脑，再用40g/L甲醛室温条件下固定24～48h，随后进行脱水和透明，然后石蜡包埋，接着切片，切片厚度取3μm，行免疫组化检测所有组大鼠脑组织中p-Akt和HIF-1α的蛋白表达情况；每组另外随机各取8只，经乙醚吸入麻醉之后，开颅取脑，在冰袋上快速的分离左侧的新生大鼠的脑皮质，迅速置入液氮，以备RT-PCR用，检测所有组的新生大鼠左边的脑皮质内HIF-1αmRNA表达情况。结果1免疫组化结果显示：HIF-1α及p-Akt蛋白细胞分布主要在脑皮质和海马的神经细胞，他们在细胞内的具体定位不同，其中，HIF-1α多数在细胞核，少数在细胞质，而p-Akt主要在神经元的胞浆内和胞膜上。2假手术组大脑皮质p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表达水平依次为8.080±0.369、38.581±2.846，0.174±0.015；模型对照组缺血侧大脑皮质p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表达水平依次为50.168±4.259、72.795±6.121、0.448±0.035；溶剂干预组大脑皮质p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表达水平依次为52.199±3.850、78.481±5.080、0.439±0.035；上述p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表达水平，模型对照组较假手术组升高，差异均具有统计学意义(p＜0.05)，而模型对照组与溶剂干预组相比，差异均无统计学意义（p>0.05）。3T4干预组缺血侧大脑皮质p-Akt蛋白、HIF-1α蛋白及HIF-1αmRNA表达水平依次为82.765±6.271、117.350±9.374及0.618±0.042，较模型对照组明显升高，差异有统计学意义(p＜0.05)。4在模型对照组及T4干预组，HIF-1α与p-Akt蛋白的表达水平均呈正相关，模型对照组相关系数为0.635，p=0.048；T4干预组的相关系数为0.694，p=0.026。结论1缺氧缺血可以促进新生大鼠脑组织HIF-1αmRNA及其蛋白表达，PI3K/Akt信号通路可能参与其中；2外源性补充T4可以上调新生大鼠缺氧缺血性脑损伤脑组织HIF-1αmRNA及其蛋白表达水平，PI3K/Akt信号通路可能参与其中。