研究背景世界卫生组织预测,到2030年缺血性心脏病将成为威胁人类健康的第二大疾病,其中冠状动脉梗塞引起的心肌缺血是缺血性心脏病中最重要的致死原因。心肌缺血可以启动一系列的病理生理过程,导致心脏功能障碍。冠脉梗塞后尽早对缺血区进行有效的血液再灌注,是减少心肌细胞死亡、改善心脏功能唯一有效的方法。然而临床及基础实验均发现,再灌注本身也会加重并扩大缺血后心肌的损伤,即发生再灌注损伤。因此,揭示再灌注损伤可能的机制已成为治疗缺血性心脏病的研究靶点。心肌缺血／再灌注可导致大量心肌细胞死亡,其主要形式有程序性细胞死亡和坏死。程序性细胞死亡因其本身具有可控性,现已成为研究心肌缺血／再灌注损伤机制的热点之一。细胞凋亡作为一种程序性细胞死亡的主要方式,在心肌缺血再／灌注中发挥着重要的作用,是决定缺血心肌梗死面积大小的主要因素,但其机制并不十分清楚,与这种凋亡性细胞死亡密切相关的靶蛋白也知之甚少。半胱氨酸蛋白酶家族(Caspases)是调节和执行细胞凋亡最重要的蛋白酶,其活化可导致细胞凋亡的发生。X染色体连锁凋亡抑制蛋白(X-linked Inhibitor of Apoptosis Protein, XIAP)是哺乳动物体内最强的内源性凋亡抑制蛋白,它通过与Caspases结合从而抑制其活性。我们的前期研究发现,心肌缺血／再灌注后大鼠心肌组织中XIAP蛋白水平表达降低,上调XIAP的水平可以减轻心肌缺血／再灌注损伤,因而推测XIAP的降低可能是缺血／再灌注诱导心肌损伤的原因之一。但是,心肌缺血／再灌注后心肌组织中XIAP蛋白水平表达降低的机制并不清楚；而且,XIAP的降低是否可以导致缺血／再灌注后心肌细胞的凋亡增加也需要进一步的研究证实。为此,本实验设计如下：①建立成年大鼠心肌缺血／再灌注模型,观察此过程中不同时间点心肌组织XIAP蛋白水平与mRNA水平表达的变化,以分析心肌缺血／再灌注过程中XIAP的改变情况；②给予XIAP特异性抑制剂Embelin,观察XIAP功能降低对心肌缺血／再灌注后心肌细胞凋亡和在体心功能的影响。研究目的1.观察大鼠心肌缺血／再灌注不同时间点心肌组织中XIAP动态表达特征。2.观察心肌组织中XIAP表达下降是否与大鼠心肌缺血／再灌注损伤有关。材料方法1．分别选取成年雄性SD大鼠(4-6月,n=103,死亡11只,实际用于实验研究92只)随机分为3组,即心肌缺血／再灌注组(结扎左冠状动脉前降支)、伪手术组(不结扎左冠状动脉前降支)及心肌缺血／再灌注后给药组。(1)心肌缺血／再灌注组(MI/R Group)①再灌注0小时组(R0h)：正常成年大鼠左冠状动脉前降支缺血30min,再灌注0h,n=6；②再灌注1小时组(R1h)：正常成年大鼠左冠状动脉前降支缺血30min,再灌注1h,n=7,缺血13分钟,因心室纤颤死亡1只,实际实验用鼠6只；③再灌注2小时组(R2h)：正常成年大鼠左冠状动脉前降支缺血30min,再灌注2h,n=6；④再灌注3小时组(R3h)：正常成年大鼠左冠状动脉前降支缺血30min,再灌注3h,n=6；⑤再灌注12小时组(R12h)：正常成年大鼠左冠状动脉前降支缺血30min,再灌注12h,n=7,再灌注约7小时,不明原因死亡1只,实际实验用鼠6只；⑥再灌注24小时组(R24h)：正常成年大鼠左冠状动脉前降支缺血30min,再灌注24h,n=8,再灌注10分钟,因心室纤颤死亡2只,实际实验用鼠6只。(2)伪手术组(Sham Group)随机选取36只正常成年大鼠分6组,左冠状动脉前降支下只穿线,不结扎。其余手术步骤同手术组。(3)给药组①缺血／再灌注12小时组+Vehicle组：左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注12小时,再灌注前12小时用色拉油灌胃(1ml／kg),n=12；由于心室纤颤死亡2只,实际实验用鼠10只：②缺血／再灌注12小时组+Embelin组(15只)：左冠状动脉前降支缺血30分钟,再灌注12小时,再灌注前12小时用Embelin(溶于色拉油：20mg／kg)灌胃,n=15；由于肺炎,腹部肿瘤,心室纤颤死亡5只,实际实验用鼠10只。2.各组实验动物分别经右侧颈总动脉插管进入左心室,监测左室收缩压(Left Ventricular Systolic Pressure, LVSP),左室舒张压(Left Ventricular Diastolic Pressure, LVDP),左心室压力上升／下降最大变化速率(+dp／dtmax及-dp／dtmax)等心功能指标；3.分别采用Caspase-3活性测定和DNA原位末端缺口标记法(TUNEL)检测各组心肌组织中细胞凋亡的发生情况；4.用Western Blot技术检测各组大鼠心肌组织中XIAP的蛋白表达水平；5.用Real Time PCR技术检测大鼠心肌组织中XIAP的mRNA表达水平。结果1.大鼠心肌缺血／再灌注模型的建立1.1成年大鼠心肌缺血／再灌注不同时间点的心肌细胞凋亡水平1.1.1 Caspase-3活性测定结果Caspase-3是细胞凋亡的主要执行者,其活性可以定量反应细胞凋亡水平,Caspase-3活性越大,细胞凋亡水平越高。结果显示,与伪手术组(1.00±0.21)相比,心肌缺血／再灌注大鼠心肌组织中Caspase-3比活性从再灌注1小时开始升高(1.55±0.24,P<0.05),再灌注12小时达到高峰(1.66±0.21,P<0.05),此后逐渐下降,并于再灌注24小时活性趋于正常(1.21±0.13,P>0.05)。(图4)以上结果显示：成年大鼠心肌缺血／再灌注后Caspase-3活性有一个逐渐升高、维持、后又逐渐消退的动态变化过程。1.1.2 TUNEL染色结果TUNEL染色是检测细胞凋亡的一种较灵敏的方法。用TUNEL方法检测缺血／再灌注12小时的心肌细胞凋亡水平。结果显示,心肌缺血／再灌注组大鼠心肌组织中阳性染色的凋亡细胞核明显多于伪手术组；经计算得：心肌缺血／再灌注组心肌细胞的凋亡率为14.75±1.54%,明显高于同期伪手术组(1.36±0.47％,P<0.05)。(图5)1.2成年大鼠心肌缺血／再灌注不同时间点的心功能改变1.2.1心肌收缩功能的指标+dp/dtmax, LVSP分别代表左心室压力上升最大变化速率和左心室收缩压,它们可以反映心脏收缩功能。指标数值越大,心功能越好。结果显示,+dp／dtmax从再灌注12小时(404.76±137.94Kpa/s vs.同期伪手术组633.00±59.48Kpa/s,P<0.05)开始下降,该变化一直持续至再灌注24小时(388.71±93.51Kpa/s vs.同期伪手术组653.42±61.41Kpa/s,P<0.05)。而LVSP各组间比较并无统计学差异(P>0.05)。(图6,7)1.2.2心肌舒张功能的指标-dp/dtmax,LVDP分别代表左心室压力下降最大变化速率和左心室舒张压。-dp/dtmax数值越大,心功能越好；LVDP指标数值越小,心脏舒张功能越好。结果显示,心肌缺血／再灌注组大鼠-dp/dtmax从再灌注12小时(335.00±109.00Kpa/s vs.同期伪手术组427.83±72.92Kpa/s,P<0.05)开始下降,该变化一直持续至再灌注24小时(353.71±97.21Kpa/s vs.同期伪手术组459.42±66.22Kpa/s,P<0.05)；而LVDP从再灌注12小时(1.10±0.99Kpa vs.同期伪手术组-1.00±0.77Kpa,P<0.05)开始升高,该变化一直持续至再灌注24小时(0.79±0.50Kpa vs.同期伪手术组-1.18±0.64Kpa,P<0.05)。(图8,9)以上实验结果显示：心肌缺血／再灌注后大鼠心脏的收缩和舒张功能都出现了不同程度的下降,并且在再灌注12和24小时出现明显的心功能障碍。2.成年大鼠心肌缺血／再灌注不同时间点心肌组织中XIAP表达的变化2.1成年大鼠心肌缺血／再灌注不同时间点心肌组织XIAP蛋白水平的检测用Western Blot检测成年大鼠心肌缺血／再灌注不同时间点心肌组织中XIAP蛋白表达水平。结果表明：心肌缺血／再灌注大鼠心肌组织XIAP蛋白表达从再灌注3小时开始降低(1.00±0.19 vs.同期伪手术组1.61±0.12,P<0.05),再灌注12小时达到最低值(0.65±0.16 vs.同期伪手术组1.42±0.24,P<0.05),再灌注24小时其表达有所恢复,但仍维持在较低水平(0.94±0.16 vs.同期伪手术组1.50±0.21,P<0.05)。(图10)2.2成年大鼠心肌缺血／再灌注不同时间点心肌组织中XIAP的mRNA水平检测用实时定量PCR的方法检测成年大鼠心肌缺血／再灌注不同时间点心肌组织中XIAP的mRNA表达水平。结果表明：和同期伪手术组相比,心肌缺血／再灌注组大鼠心肌组织中XIAP的mRNA水平无明显改变(P>0.05)。(图11,12,13)以上结果显示,心肌缺血／再灌注后大鼠心肌组织中XIAP的降低只发生在蛋白水平,其mRNA水平无改变。3成年大鼠心肌缺血／再灌注后心肌组织中XIAP蛋白表达与心功能之间的相关性分析3.1成年大鼠心肌缺血／再灌注心肌组织中XIAP蛋白表达与+dp／dtmax呈正相关通过对心肌缺血／再灌注心肌组织中XIAP与心肌缺血／再灌注心功能的直线相关分析,发现成年大鼠缺血／再灌注心肌组织中XIAP蛋白水平与心肌收缩力指标+dp／dtmax呈正相关(r=0.655,n=42,P<0.05)(图14),提示：XIAP表达减少可能与心肌缺血／再灌注后心脏收缩功能障碍密切相关。3.2成年大鼠缺血／再灌注心肌组织中XIAP蛋白表达与LVDP呈负相关通过对心肌缺血／再灌注心肌组织中XIAP与心肌缺血／再灌注心功能的直线相关分析,发现成年大鼠缺血／再灌注心肌组织中XIAP蛋白水平与心肌舒张功能指标LVDP呈负相关(r=-0.528,n=41,P<0.05)(图15),提示：XIAP表达减少可能与心肌缺血／再灌注后心脏舒张功能障碍密切相关。4.XIAP特异性抑制剂Embelin可使大鼠心肌缺血／再灌注后心肌细胞凋亡增加,并加重在体心功能障碍4.1 XIAP特异性抑制剂Embelin可使大鼠心肌缺血／再灌注后心肌细胞凋亡增加4.1.1 Caspase-3活性测定由前一部分研究得知,本实验采取的心肌缺血／再灌注模型于再灌注12小时Caspase-3活性最大,因此选用该时间点做为Caspase-3活性的观察点。结果显示,与Vehicle组Caspase-3比活性(1.00±0.16)相比,给予XIAP特异性抑制剂]Embelin使心肌缺血／再灌注12小时Caspase-3的比活性显著升高(1.49±0.36,P<0.05) (图16)4.1.2 TUNEL染色结果本实验用TUNEL方法检测了缺血／再灌注12小时后心肌细胞的凋亡水平。结果显示,心肌缺血／再灌注12小时心肌组织中有少量阳性染色凋亡细胞；给予XIAP特异性抑制剂]Embelin后,心肌组织中阳性染色的凋亡细胞显著增多。经计算得出：心肌缺血／再灌注12小时心肌细胞凋亡率为(16.02±1.73%),给予XIAP特异性抑制剂Embelin后心肌组织中阳性细胞凋亡率明显增加(22.97±1.60%,P<0.05)(图17)。以上结果显示：给予XIAP特异性抑制剂Embelin可进一步增加大鼠心肌缺血／再灌注后心肌细胞凋亡。4.2 XIAP特异性抑制剂Embelin可加重大鼠心肌缺血／再灌注后心功能障碍4.2.1心肌收缩功能的指标与Vehicle组心功能收缩指标(+dp／dtma 408.63±89.92Kpa/s;LVSP 12.784±1.78 Kpa)相比,给予XIAP特异性抑制剂Embelin使心肌缺血／再灌注12小时后心室收缩功能明显下降(+dp／dtmax 308.13±94.22Kpa／s,P<0.05；LVSP 10.84±1.58 Kpa,P<0.05)。(图18,19)4.2.2心肌舒张功能的指标与Vehicle组心功能舒张指标LVDP(0.52±1.10Kpa)相比,给予XIAP特异性抑制剂Embelin后可使心肌缺血／再灌注12小时后LVDP明显增高(1.64±0.88Kpa,P<0.05),即舒张功能明显下降,但-dp／dtmax两组间比较并无统计学差异(P>0.05)(图20,21)。以上结果提示：给予XIAP特异性抑制剂Embelin可以显著加重心肌缺血／再灌注12小时后心功能障碍。结论本研究首次发现,成年大鼠心肌缺血／再灌注后心肌组织中XIAP蛋白表达的变化与心肌细胞凋亡水平及在体心功能改变之间存在时间上的相关性,并且给与XIAP特异性抑制剂]Embelin可增加心肌缺血／再灌注后心肌细胞凋亡,加重在体心功能障碍。这些结果均提示心肌缺血／再灌注后,大鼠心肌组织中XIAP蛋白水平的降低参与了心肌缺血／再灌注诱导的心肌损伤。